[發明專利]一種靶向結腸癌的重組蛋白及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201810075231.7
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108047335A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 柳增善;張嵩;王海波;李萌;胡盼;任洪林;盧士英;常江;史永亮
• 申請（專利權）人: 上海杵焱健康科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/16;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

1.一種靶向結腸癌的重組蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

2.編碼如權利要求1所述的靶向結腸癌的重組蛋白的核苷酸序列，其特征在于：該核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

3.如權利要求1所述的靶向結腸癌的重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括下列步驟：

(一)通過基因擴增獲得靶向結腸癌的重組蛋白的重組DNA，核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，通過NcoI和BamHI酶切位點，將該重組DNA克隆入pET28a載體，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，挑取單克隆細胞培養保存；

(二)將重組大腸桿菌BL21(pET28a-rCCK8PE38)接種于2xYT培養基中，37℃持續搖培至OD600達到0.5，加入誘導劑異丙基硫代半乳糖苷IPTG至終濃度0.6mM，27℃搖培5小時后，離心收集菌體，12000g，15min，4℃；

(三)按照1g：20ml的比例用磷酸鹽緩沖液PBS重懸菌體，使用超聲破碎儀破碎菌體，離心收集上清中的可溶性蛋白，12000g，120min，4℃；

(四)將步驟(三)收集的蛋白溶液進行純化，步驟如下：

a)在步驟(三)獲得的蛋白溶液中緩慢滴加飽和硫酸銨溶液，至終飽和度10％，低溫離心，12000g，5min，4℃，收集上清液；在上清液中繼續滴加飽和硫酸銨溶液，至終飽和度30％，低溫離心，12000g，5min，4℃，收集沉淀；

b)使用上樣緩沖液，20mmol/L Tris-HCl,3mol/L NaCl,1mmol/L EDTA,pH 7.4，重懸步驟a)沉淀物，經蛋白純化系統，上樣到疏水層析介質Phenyl HP，再以3-0mol/L氯化鈉濃度梯度洗脫，收集0.9-0mol/L氯化鈉濃度洗脫下的蛋白溶液；

c)將步驟b)收集的蛋白溶液經蛋白純化系統，上樣到分子排阻層析介質G-25除鹽，其緩沖體系被置換為：20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 6.0；

d)將步驟c)獲得的蛋白溶液經蛋白純化系統，上樣到離子交換層析介質DEAEFF，再以0-1mol/L氯化鈉濃度梯度洗脫，收集0.5-0.7mol/L氯化鈉濃度洗脫下的蛋白溶液；

e)將步驟d)獲得的蛋白溶液經蛋白純化系統，上樣到分子排阻層析介質G-25除鹽，其緩沖體系被置換為保存液，50mmol/L Na3PO4，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH7.4，經上述純化后的靶向結腸癌的重組蛋白的純度可達95％以上。

4.如權利要求1所述的一種靶向結腸癌的重組蛋白在制備治療結腸癌藥物中的應用。

5.如權利要求4的所述的一種靶向結腸癌的重組蛋白在制備治療結腸癌藥物中的應用，其特征在于：靶向結腸癌的重蛋白作用于HCT116人結腸癌裸鼠模型，能夠顯著抑制腫瘤的生長和擴散。