[發明專利]檢測靶核酸序列的引物、熒光探針及方法

在審

• 申請號: 201810074793.X
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108359724A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 黃劭;宋方麗;張家劍;鄧銀翔;王鵬
• 申請（專利權）人: 江西賢聚景欣醫藥生物科技有限公司;江西耀陽醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6818;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 黃培智

本發明公開了一種檢測靶核酸序列的引物、熒光探針及方法，所述引物的近3’端修飾有淬滅基團或熒光基團，所述熒光探針的近3’端修飾有熒光基團或淬滅基團，以待檢測核酸序列為模板，以上述引物及熒光探針進行PCR反應，反應后進行溶解曲線分析，繪制溶解曲線，即可用于檢測靶核酸序列，本發明的檢測方法特異性強，靈敏度高，探針之間的本底信號不會互相干擾，使得多重PCR的判讀更加清晰。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，更具體地，本發明涉及一種檢測靶核酸序列的引物、熒光探針及方法。

背景技術

熒光PCR技術是檢測靶核酸序列的常用技術，目前常用的熒光PCR檢測方法包括Taqman探針法、分子信標(Molecular Beacon)探針法、熒光雜交雙探針(HybridizationProbe)法等。其中熒光雜交雙探針法主要通過使用兩條可與靶序列同一條單鏈雜交的熒光探針，其中一條探針3’端修飾一種熒光基團，另一條探針5’端修飾另一種熒光基團，當靶序列存在時通過非對稱PCR產生大量可與這兩條熒光探針反向互補的單鏈，當兩條熒光探針首尾相連與反向互補的單鏈DNA雜交時，第一條探針3’端的熒光基團與第二條探針5’端的另一個熒光基團在空間距離上縮短，引發熒光能量共振轉移，所引起的熒光信號強弱變化可以用來檢測靶序列的存在。

熒光探針溶解曲線分析技術是基于不對稱PCR擴增技術的一種定性檢測方法。利用分子信標探針、Fret探針或Taqman探針在不對稱PCR反應后進行溶解曲線分析，可因為所結合序列變化所造成的溶解曲線峰值變化，從而分辨不同的靶序列位點。這項技術主要優勢在于可以利用不同熒光通道和不同熒光探針溶解峰溫度的組合同時檢測多個檢測位點，而且設計良好的探針可以通過溶解峰的變化分辨不同的突變位點。

目前熒光探針溶解曲線技術在同一熒光通道使用多條熒光探針進行檢測時，即使熒光探針未與靶序列結合，探針自身或探針之間在低溫條件下互相纏繞誤雜交也會產生背景信號，多條熒光探針的背景信號之間互相干擾疊加，造成熒光背景過高，從而影響了溶解曲線的判讀。

發明內容

為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種檢測靶核酸序列的引物、熒光探針及方法，該方法基于引物上淬滅基團對雜交探針熒光進行淬滅，使得多條檢測探針的背景信號之間不會互相干擾疊加。

為了實現上述發明目的，本發明采取了以下技術方案：

一種檢測靶核酸序列的引物，該引物的近3’端修飾有淬滅基團或熒光基團。

在其中一些實施例中，所述淬滅基團為BHQ1、BHQ2、或BHQ3，所述熒光基團為FAM、HEX、ROX、或Cy5。

在其中一些實施例中，所述引物為正向引物或反向引物。

在其中一些實施例中，所述淬滅基團或熒光基團與所述引物的3’端末尾距離1-20個堿基。

在其中一些實施例中，所述淬滅基團或熒光基團與所述引物的3’端末尾距離1-10個堿基。

本發明還提供了一種檢測靶核酸序列的熒光探針，所述熒光探針與權利要求1～5任一項所述的引物與DNA的不同單鏈互補，所述熒光探針的近3’端修飾有熒光基團或淬滅基團，且當所述引物修飾有熒光基團時，所述熒光探針修飾有淬滅基團，當所述引物修飾有淬滅基團時，所述熒光探針修飾有熒光基團。

在其中一些實施例中，所述淬滅基團為BHQ1、BHQ2、或BHQ3，所述熒光基團為FAM、HEX、ROX、或Cy5。

在其中一些實施例中，所述熒光基團或淬滅基團與熒光探針的3’端末尾距離0-20個堿基。

在其中一些實施例中，所述熒光基團或淬滅基團與熒光探針的3’端末尾距離0個堿基，即直接修飾在3’端末尾。

本發明還提供了一種檢測靶核酸序列的方法，包括以下步驟：