[發(fā)明專利]前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810073775.X
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN110079539B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳國友
• 申請（專利權(quán)）人: 上海惠盾因泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N9/16;C12N5/10;C07K14/535
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 肖艷;徐迅

本發(fā)明涉及前列腺酸性磷酸酶/粒?巨噬細(xì)胞集落刺激因子制備方法。具體地，本發(fā)明涉及一種用于編碼前列腺酸性磷酸酶/粒?巨噬細(xì)胞集落刺激因子PAP/GM?CSF的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。本發(fā)明還提供了高效表達(dá)PAP/GM?CSF的表達(dá)載體、工程細(xì)胞及制備方法等。本發(fā)明構(gòu)建的PAP/GM?CSF表達(dá)工程細(xì)胞具有表達(dá)量高，表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點，所采取的純化工藝穩(wěn)定可靠，得率高，利于大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組融合蛋白的制備，具體涉及一種前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的制備方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)

前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)是人類前列腺組織中最豐富的酶，分子量為100kD，由兩個催化活性的亞基通過非共價鍵結(jié)合形成一個活性酶二聚體。PAP的二級結(jié)構(gòu)由44％的α-螺旋、12％的β-折疊，其余的都是β轉(zhuǎn)角和環(huán)構(gòu)成，人源前列腺酸性磷酸酶(human prostatic acid phosphatase,hPAP)的活性主要依賴其蛋白的二級結(jié)構(gòu)。PAP在體內(nèi)有兩種存在形式：分泌型PAP(secreted prostatic acid phosphatase,S-PAP)和跨膜型PAP(transmembrane prostatic acid phosphatase,TM-PAP)。S-PAP為前列腺上皮細(xì)胞合成和分泌，貯存于精囊，參與精液液化與生殖，其產(chǎn)生和分泌受雄激素的調(diào)節(jié)，具有組織特異性。正常狀態(tài)下，S-PAP在血中含量極低，只有在疾病狀態(tài)(如前列腺癌)下才大量進(jìn)入血液，并可產(chǎn)生抑癌作用。因此近五十年來，PAP一直被作為前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物及特異性免疫治療的靶點用于臨床診斷和治療。TM-PAP分布于細(xì)胞膜上，其C端帶有跨膜結(jié)構(gòu)域，主要表達(dá)于非前列腺組織，如神經(jīng)組織、肝臟等。TM-PAP位于胞外的N端部分結(jié)構(gòu)與S-PAP完全相同，包含一個信號肽和酸性磷酸酶結(jié)構(gòu)域。

目前，前列腺癌是危害男性健康常見的惡性腫瘤，在美國前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為危害男性健康第一位的腫瘤。中國的前列腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢。前列腺癌的治療方法有很多中，但對于激素抵抗性前列腺癌的治療目前仍沒有有效的方法，化療盡管對激素抵抗性前列腺癌的生存率有一定作用但其作用相當(dāng)有限，故仍然需要更有效的治療方法。腫瘤疫苗是目前一種新的腫瘤治療方法，通過特異性抗原激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，識別腫瘤細(xì)胞進(jìn)而特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。由于分泌型PAP是只在前列腺組織和95％的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)的抗原分子，PAP已成為轉(zhuǎn)移性非雄激素依賴性前列腺癌特異性的免疫治療的熱門靶點，以其為中心的各項免疫治療研究正在進(jìn)行。Johnson等成功構(gòu)建了編碼人PAP的質(zhì)粒DNA疫苗(pTVG.HP)和病毒載體疫苗(VV-HP)，并將其分別免疫Lewis大鼠，結(jié)果證實編碼人PAP的質(zhì)粒DNA疫苗能夠誘導(dǎo)PAP特異性CD4和CD8細(xì)胞反應(yīng)，主要是Thl型免疫反應(yīng)，PAP特異性IgG抗體反應(yīng)成劑量依賴性，抗體滴度隨免疫的次數(shù)而增加(Johnson LE,Frye TP,Chinnasamy N,et al.Plasmid DNA vaccine encodingprostatic acid phosphatase is effective in eliciting autologous antigen-specific CD8+T cells.Cancer Immunol Immunother.2007Jun；56(6):885-95)。但是單獨的PAP免疫原性很弱。

因此本領(lǐng)域亟需開發(fā)一種高效表達(dá)制備PAP疫苗的方法、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，對于前列腺癌疫苗的制備具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效表達(dá)制備PAP疫苗的方法、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于編碼前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子PAP/GM-CSF的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。