[發明專利]一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法

有效

• 申請號: 201810073368.9
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108018334B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 賈芳;楊江流
• 申請（專利權）人: 河套學院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 韓曉娟

本發明涉及生物酶活性測定技術領域，特別涉及一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法，包括：提取大腸桿菌質粒DNA；以質粒DNA為模板，PCR擴增出編碼整合酶的整合子基因intI，并連接到表達載體pEASY?E1上，再轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中；PCR擴增出含整合酶基因重組位點attI和基因盒基因重組位點attC的DNA片段，并連接到載體質粒PUC19上，再轉化到大腸桿菌DH5α；實時熒光定量PCR測定發生整和作用的拷貝數和未發生作用的拷貝數，計算整合效率，得整合酶活性大小。本發明分別構建帶有整合酶的整合子基因intI的載體和含整合酶基因重組位點attI和基因盒基因重組位點attC的載體，體外測定并計算整合效率的大小，從而反應出整合酶活性大小，為研究大腸桿菌的耐藥性提供理論基礎。

技術領域

本發明涉及生物酶活性測定技術領域，特別涉及一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法。

背景技術

大腸桿菌是一種常見致病菌，由于抗生素的廣泛持續的不當使用，導致大腸桿菌耐藥株的大量出現，使臨床對大腸桿菌病的治療變得十分困難，有時甚至找不到可治之藥，因此，近年來大腸桿菌的耐藥性研究是熱點。

整合子是一種運動性的DNA分子，具有獨特結構可捕獲和整合外源性基因，使之轉變為功能性基因的表達單位，整合子可位于質粒、染色體或自身作為轉座子的一個組成部分而參與轉移，整合子由3個部分組成：5′保守末端、3′保守末端和兩者之間的可變區。5′保守末端是整合子的基本結構，包括編碼整合酶的基因(intI)、整合子重組位點attI和整合子可變區啟動子(Pant)。IntI屬于酪氨酸整合酶家族的基因，催化基因盒在整合子重組位點attI和基因盒重組位點attC之間的整合和剪切。attC位點是一個不完全的反向重復序列,并含有一個可被整合酶識別的特異性整合位點。attC位點的長度為57～141bp,其最高度保守的特征是兩個7bp的核心位點:核心位點GTTRRRY和與之相對稱的反向核心位點RYYYAAC。可變區是插入編碼某種功能的基因，如耐藥基因，稱為基因盒(gene cassette)，目前發現了超過80多種包括抗生素耐藥在內的基因盒?；蚝锌偸且?′-3′的方向整合入整合子,使其可以在上游啟動子Pant的作用下得以表達。被捕獲的基因盒5′端與整合酶的att I結合而3′端與attC發生特異性整合。

2009年Julia E等認為整合酶整合有兩種機制，第1種:整合酶從整合子(供體)中切除的一個基因盒形成一個共價閉環,然后它插入到另一整合子(受體)的attC位點；第2種:整合酶重組的供體和受體質粒,這些質粒都是由att I或者attC位點所形成的單一的共聯體質粒,它們可由整合酶分成兩個單獨的質粒,一個質粒(受體)通過盒捕捉獲得基因盒,另一質粒則失去。這兩種機制它們所形成的最后的盒捕捉產物通過序列測定是沒有區別的。2008年楊澤華博士做整合子捕獲基因盒效率調控機制的研究，建立了測定整合子捕獲基因盒效率的新方法。2010年魏取好博士做了細菌整合子捕獲與表達耐藥性基因盒調控機制的研究，建立了第1類整合子快速基因定位方法。

基因治療工具酶phiC31在體外整合活性方法已經建立，HIV-1整合酶體外活性檢測方法也已建立，但是細菌耐藥性整合酶體外活性測定方法未見報道，細菌通過整合作用捕獲外來的耐藥基因，使細菌具有耐藥及多重耐藥性，造成細菌多重耐藥性的傳播，所以往往整合酶的活性能體現細菌耐藥性的強弱，細菌通過整合子系統表達的整合酶，可使attI和attC位點發生整合作用而使同鏈的attI和attC位點之間的DNA序列長度發生改變，因此整合酶的整合效率的大小就反應了整合酶活性大小。為此，本發明提供了一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法。

發明內容

本發明提供一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法，測定了大腸桿菌整合酶整合過程中的整合效率，從而反應出整合酶活性大小，為研究大腸桿菌的耐藥性提供理論基礎。

本發明解決技術問題的方案是：一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法，包括以下步驟：

S1，提取大腸桿菌質粒DNA；