[發(fā)明專利]一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810073368.9 | 申請日： | 2018-01-25 |
| 公開（公告）號： | CN108018334B | 公開（公告）日： | 2021-07-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 賈芳;楊江流 | 申請（專利權(quán)）人： | 河套學(xué)院 |
| 主分類號： | C12Q1/6851 | 分類號： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61223 | 代理人： | 韓曉娟 |
| 地址： | 015000 內(nèi)蒙*** | 國省代碼： | 內(nèi)蒙古;15 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 耐藥性 大腸桿菌 整合 活性 測定 方法 | ||
1.一種耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1，提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA；
S2，以S1中的質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計特異性引物，PCR擴增出編碼整合酶的整合子基因
上游引物Int-F：5’-ccggaattccggacgcgtctgacccccaa-3’，
下游引物Int-R：5’-cccaagcttgggcccgccgctgagatgc-3’；
S3，以S1中質(zhì)粒DNA為模板設(shè)計與載體質(zhì)粒PUC19具有相同酶切位點和保護性堿基的特異性引物，PCR擴增出含整合酶基因重組位點
上游引物attIF：5’-tgatgttatggagcagcaacg-3’，
下游引物attCR：5’-acctaacgtttgacatgagggg-3’；
S4，將S2中的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）與S3中的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α過夜共培養(yǎng)，用實時熒光定量PCR測定發(fā)生整合作用的拷貝數(shù)A和未發(fā)生整合作用的拷貝數(shù)B，按公式C=A/(A+B)計算整合效率C；或者分別提取S2中的轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）和S3中的轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的質(zhì)粒，并在Tris-HCl、NaCl、EDTA、甘油混合反應(yīng)體系中加熱，用實時熒光定量PCR測定發(fā)生整合作用的拷貝數(shù)A1和未發(fā)生整合作用的拷貝數(shù)B1，按公式C1=A1/(A1+B1)計算整合效率C1；其中，實時熒光定量PCR測定時，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐藥性大腸桿菌整合酶活性測定方法，其特征在于，S4中每升Tris-HCl、EDTA、甘油混合反應(yīng)體系的配方為：20mmol Tris-HCl 100mmol NaCl、0.1 mmolEDTA、20ml質(zhì)量濃度為1%的甘油，雙蒸水定容至1L，反應(yīng)體系的pH為7.5；反應(yīng)條件：37℃，1小時，然后80℃，20min。
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