[發(fā)明專利]大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810073342.4
• 申請(qǐng)日: 2018-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN108181334B
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳意樊;劉清華;李軍;徐世宏;王彥豐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海洋大學(xué);中國(guó)科學(xué)院海洋研究所
• 主分類號(hào): G01N23/22
• 分類號(hào): G01N23/22;G01N23/2202;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/36
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

本發(fā)明公開了大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法，包括：固定、預(yù)染色、脫水與包埋、醋酸雙氧鈾染色、檸檬酸鉛染色、制片分析，將大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)過程劃分為8個(gè)階段：包括精細(xì)胞Ⅰ?Ⅶ期和成熟精子。有益效果為：本細(xì)胞學(xué)劃分方法克服了普通組織學(xué)切片觀察中由于放大倍數(shù)有限導(dǎo)致無(wú)法區(qū)分不同變態(tài)時(shí)期精細(xì)胞的問題，預(yù)染色有助于提高染色均勻度、組織結(jié)構(gòu)清晰度以及組織染色反差度，可優(yōu)化染色效果，顯著增強(qiáng)精細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的圖像清晰度；大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法不僅填補(bǔ)了鲆鰈魚類精細(xì)胞變態(tài)階段劃分的研究空白，同時(shí)還可以應(yīng)用于其他海水魚類的精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及魚類精細(xì)胞變態(tài)領(lǐng)域，尤其是涉及大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法。

技術(shù)背景

精細(xì)胞變態(tài)（spermiogenesis），又稱精子形成，是精子發(fā)生的最后階段：完成第二次減數(shù)分裂的精細(xì)胞（spermatid）經(jīng)過細(xì)胞核的濃縮、尾部的形成和殘余體的吸收，由圓形細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓木樱╯permatozoa）。精細(xì)胞變態(tài)過程決定了精子最終的結(jié)構(gòu)組裝和激活功能的實(shí)現(xiàn)。該過程直接決定了產(chǎn)精時(shí)機(jī)、產(chǎn)精數(shù)量及產(chǎn)精質(zhì)量。

遺憾的是，魚類中有關(guān)精細(xì)胞變態(tài)時(shí)期的組織學(xué)及亞顯微結(jié)構(gòu)報(bào)道十分有限且非常零散，受普通光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)的限制，難以通過組織學(xué)切片方法觀察和區(qū)分不同變態(tài)階段的精細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因此，尚缺乏對(duì)包括大菱鲆在內(nèi)的海水魚類精細(xì)胞變態(tài)階段的系統(tǒng)劃分，致使海水魚類的精細(xì)胞變態(tài)研究停滯不前。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法，本細(xì)胞學(xué)劃分方法直觀、精確，亞顯微結(jié)構(gòu)下精細(xì)胞變態(tài)階段的各個(gè)時(shí)期特征明顯，易于鑒別，而且精確度較高。

本發(fā)明的目的之二在于提供大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法的應(yīng)用，大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法可以應(yīng)用于其他海水魚類的精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分，為其他海水魚類的精細(xì)胞變態(tài)研究提供科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：大菱鲆精細(xì)胞變態(tài)階段的細(xì)胞學(xué)劃分方法，包括：固定、預(yù)染色、脫水與包埋、醋酸雙氧鈾染色、檸檬酸鉛染色、制片分析，具體包括以下步驟：

固定：采集處于Ⅳ-Ⅴ期的大菱鲆精巢，將精巢組織置于1-4℃、2.0-3.0%的戊二醛溶液中，將25%的戊二醛溶液溶解于磷酸緩沖溶液中得到2.0-3.0%的戊二醛溶液，于4-5℃固定3-4小時(shí)；用磷酸緩沖液沖洗3-4次，再在4-5℃溫度下用1.1-1.3%的鋨酸后固定1.0-1.5小時(shí)；戊二醛溶液與鋨酸固定可以使精細(xì)胞中的物質(zhì)盡量接近其生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置，可以防止精細(xì)胞自溶與腐敗，防止細(xì)胞內(nèi)的酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分解，使細(xì)胞內(nèi)的各種成分如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)并便于染色與分析；

預(yù)染色：將固定后的精巢組織用磷酸緩沖液沖洗3-4次，取0.4-0.5%的醋酸雙氧鈾溶液在1-4℃溫度下將精巢組織浸泡染色過夜，取出后以無(wú)CO₂蒸餾水中清洗掉多余染液，然后以磷酸緩沖液沖洗3-4次待用；預(yù)染色有助于提高染色均勻度、組織結(jié)構(gòu)清晰度以及組織染色反差度，預(yù)染色操作可優(yōu)化染色效果，顯著增強(qiáng)精細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的圖像清晰度；

脫水與包埋：以梯度濃度為50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液脫水，每個(gè)濃度處理15-18分鐘，然后以100%酒精處理20-25分鐘，再以純環(huán)氧乙烷處理20-25分鐘，脫水完成后以Epon812樹脂包埋；脫水操作可以清除游離水以便于包埋劑均勻滲透，應(yīng)由低到高逐級(jí)脫水，不能急劇脫水，更換溶液要迅速，以免組織內(nèi)外產(chǎn)生氣泡；