[發明專利]大菱鲆精細胞變態階段的細胞學劃分方法有效
| 申請號： | 201810073342.4 | 申請日： | 2018-01-25 |
| 公開（公告）號： | CN108181334B | 公開（公告）日： | 2021-11-16 |
| 發明（設計）人： | 柳意樊;劉清華;李軍;徐世宏;王彥豐 | 申請（專利權）人： | 浙江海洋大學;中國科學院海洋研究所 |
| 主分類號： | G01N23/22 | 分類號： | G01N23/22;G01N23/2202;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/36 |
| 代理公司： | 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213 | 代理人： | 吳秉中 |
| 地址： | 316000 浙江省舟*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 大菱鲆 精細 變態 階段 細胞學 劃分 方法 | ||
1.大菱鲆精細胞變態階段的細胞學劃分方法，包括：固定、預染色、脫水與包埋、醋酸雙氧鈾染色、檸檬酸鉛染色、制片分析，其特征在于：
固定：采集處于Ⅳ-Ⅴ期的大菱鲆精巢，將精巢組織置于戊二醛溶液，于4℃固定3.5小時，用磷酸緩沖液沖洗3次，再在4℃溫度下用1.2%的鋨酸后固定1.0小時；
預染色：將固定后的精巢組織用磷酸緩沖液沖洗3-4次，取醋酸雙氧鈾溶液將精巢組織浸泡染色過夜，取出后以無CO2蒸餾水清洗掉多余染液，然后以磷酸緩沖液沖洗3-4次待用；
脫水與包埋：以梯度濃度乙醇溶液脫水，然后以100%酒精處理20-25分鐘，再以純環氧乙烷處理20-25分鐘，脫水完成后以Epon812樹脂包埋；
醋酸雙氧鈾染色：用切片機切片，把一張濾紙平鋪在有蓋平皿底部，用磷酸緩沖液將濾紙潤濕，上放一小片干凈牙科蠟，將醋酸雙氧鈾染液滴于蠟塊上，迅速蓋上平皿蓋，將載有切片的載網浮在液滴上，切片朝下染色3-5分鐘，取出將切片與載網置于無CO2蒸餾水中清洗3-4次即可；
檸檬酸鉛染色：以0.15-0.18mol/L NaOH溶液浸濕濾紙，取檸檬酸鉛溶液按照醋酸雙氧鈾染色步驟進行染色，染畢，先后用0.03-0.04mol/LNaOH溶液和無CO2蒸餾水連續沖洗4-5次以除去載網上多余染液，載網清洗后置于培養皿的濾紙上干燥；
制片分析：使用透射電子顯微鏡對染色完畢的切片觀察和拍照，根據透射電鏡照片中的亞顯微結構特征將大菱鲆精細胞變態過程劃分為精細胞Ⅰ期、精細胞Ⅱ期、精細胞Ⅲ期、精細胞Ⅳ期、精細胞Ⅴ期、精細胞Ⅵ期、精細胞Ⅶ期與成熟精子；
所述固定步驟的戊二醛溶液的制備 包括：將1.2g戊二醛、0.2g鄰氯對硝基苯酚、0.015g4-羥基-3,5-二溴-苯甲醛溶解于98.6g、0.1mol/L、pH為7.2的磷酸緩沖溶液中溶解完全即得，所述固定步驟中的戊二醛溶液溫度是1-4℃；
所述制片分析步驟中的精細胞包括：
a.精細胞Ⅰ（Spermatid Ⅰ）：減數第二次分裂結束后，次級精母細胞分化為精細胞，細胞核內出現少量異染色質，雙層核膜周圍著色逐步加深，該時期的精細胞為卵圓形，并沒有尾部；
b.精細胞Ⅱ（Spermatid Ⅱ）：該時期，精細胞形狀不規則，雙層膜結構清晰，形成中心粒復合體的雛形，包括近端中心粒（Proximal centriole）、中心粒間體（Intercentriolarbody）和遠端中心粒（Distal centriole）共三個部分；中心粒復合體分布于靠近細胞膜的細胞核中，近端中心粒與遠端中心粒形成一定夾角，近端中心粒緊貼核膜，在其基部延伸出鞭毛結構，為“9+2”形式，形成原始的尾部結構，且尾基部與細胞核邊緣齊平，尚未向細胞核內凹陷形成植入窩，細胞質內有大量的線粒體和囊泡結構；
c.精細胞Ⅲ（Spermatid Ⅲ）：該時期，中心粒復合體結構進一步成熟，近端中心粒與遠端中心粒仍存在一定夾角，尾基部向細胞核內凹陷約占核1/3并形成植入窩，染色質開始向尾部一側集中，細胞核于植入窩一側變成顆粒狀，染色加深，細胞形狀不規則，且細胞質內的囊泡增大增多；
d.精細胞Ⅳ（Spermatid Ⅳ）：中心粒復合體旋轉，近端中心粒與遠端中心粒間的夾角逐步消失，兩者位于同一直線上，植入窩進一步內陷約占核1/2，鞭毛與細胞核邊緣的細胞膜便圍成一個狹窄的空腔，即袖套腔（Central space of sleeve）；細胞核進一步向尾部一側濃縮，隨同中心粒復合體陷入細胞核的鞭毛前端外圍的細胞質中相對整齊的排列著8-9條致密線狀物質，橫切面上表現為大致呈圓圈狀排列的8-9個致密顆粒，即鞭毛衛星體，細胞質中出現大型線粒體，逐步向其預定位置即尾基部移動；
e.精細胞Ⅴ（Spermatid Ⅴ）：該時期細胞核內染色質急劇凝縮，染色質電子密度明顯增大，染色質由細小顆粒變為粗大顆粒，細胞核體積明顯縮小，精細胞核雛形顯現，大型線粒體在精細胞尾基部開始組裝，細胞質其他區域殘余體囊泡繼續增多，空泡化加強；
f.精細胞Ⅵ（Spermatid Ⅵ）：該時期精細胞核內染色質電子密度進一步增大，標志發育事件是形成2-3層核膜，大型線粒體圍繞尾基部進一步組裝完善，細胞質殘余體空泡化進一步增強，形變較大，且有向尾部偏移和逐步脫離精細胞的趨勢；
g.精細胞Ⅶ（Spermatid Ⅶ）：該時期精細胞核進一步濃縮，但尚未形成高電子密度的均勻物質，其中可見少量空隙，已經可以觀察到精細胞核內存在部分空泡結構，大部分細胞質殘余體脫落，剩余部分殘余體聚集在細胞核下方，線粒體體積增大到最終狀態；
h.精子（Spermatozoa）：該時期，細胞核已濃縮成高電子密度的均勻物質，其中可見少量空泡結構，殘余體已完全脫落，線粒體組裝完畢，精細胞變態完成，形成成熟精子。
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