[發(fā)明專利]一種小公魚免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810072882.0
• 申請(qǐng)日: 2018-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN108396047A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊最素
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P21/06
• 分類號(hào): C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

一種小公魚免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法，所述的制備方法包括：選取原料小公魚進(jìn)行酶解獲得小公魚蛋白肽，將獲得的小公魚蛋白肽作用于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行篩選酶解條件，通過分離純化獲得小公魚免疫調(diào)節(jié)肽產(chǎn)品，通過酶解獲得小公魚蛋白肽是：a）將原料小公魚清洗后搗碎制成漿料，b）酶解：選用蛋白酶對(duì)小公魚漿料進(jìn)行酶解，制成酶解液；c）超濾：將酶解液加入超濾系統(tǒng)，用10KD、5KD、3KD的超濾膜進(jìn)行超濾，收集>10KD、10?5KD、5?3KD和<3KD分子量的酶解液；d）將酶解液用葡聚糖凝膠Sephadex G25進(jìn)行凝膠柱層析和緩沖液洗脫，分別收集各峰后，將其作用于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行篩選酶解條件，獲得相應(yīng)的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色譜純化；e）經(jīng)過反相高效液相色譜(純化及氨基酸序列檢測(cè)，獲得小公魚免疫調(diào)節(jié)肽。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種小公魚免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法，屬于免疫類生物制品技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

免疫系統(tǒng)是人體進(jìn)行自我防衛(wèi)的重要系統(tǒng)。病原體等有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)后，免疫系統(tǒng)便自動(dòng)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，通過識(shí)別、阻擋或吞噬抗原，維護(hù)人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而非正常的免疫調(diào)節(jié)也會(huì)對(duì)人體造成一定的傷害，如免疫缺陷病、自身免疫疾病、超敏反應(yīng)等。目前，由免疫力低下導(dǎo)致的癌癥、腫瘤疾病正處于高發(fā)階段。然而陸地資源不斷減少以及海洋探索技術(shù)日異月新的發(fā)展，使得海洋生物資源的應(yīng)用與開發(fā)越來越受到關(guān)注。海洋廣闊的地域和復(fù)雜的環(huán)境因素造就了海洋生物的多樣性和特殊性。近年來，我國(guó)的研究學(xué)者從海洋生物中提取生物活性肽對(duì)免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行了大量的研究。

小公魚屬于鳀科魚類，為短生命周期和短食物鏈的魚類，生長(zhǎng)迅速，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是食用動(dòng)物蛋白的來源之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種通過酶解獲得蛋白肽，且酶解反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、效率高，反應(yīng)過程易控制，蛋白肽得率高，對(duì)免疫調(diào)節(jié)功能作用明顯的小公魚免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的，一種小公魚免疫調(diào)節(jié)肽的制備方法，所述的制備方法包括：選取原料小公魚進(jìn)行酶解獲得小公魚蛋白肽，將獲得的小公魚蛋白肽作用于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行篩選酶解條件，通過分離純化獲得小公魚免疫調(diào)節(jié)肽產(chǎn)品。

作為優(yōu)選：所述的選取原料小公魚進(jìn)行酶解獲得小公魚蛋白肽是：

a）將原料小公魚清洗后搗碎制成漿料，

b）酶解：選用蛋白酶對(duì)小公魚漿料進(jìn)行酶解，制成酶解液；

c）超濾：將酶解液加入超濾系統(tǒng)，用10KD、5KD、3KD的超濾膜進(jìn)行超濾，收集&gt;10KD、10-5KD、5-3KD和&lt;3KD分子量的酶解液；

d）將酶解液用葡聚糖凝膠Sephadex G25進(jìn)行凝膠柱層析和緩沖液洗脫，分別收集各峰后，將其作用于體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行篩選酶解條件，獲得相應(yīng)的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色譜(RT- HPLC)純化；

e）經(jīng)過反相高效液相色譜(RT- HPLC)純化及氨基酸序列檢測(cè)，獲得小公魚免疫調(diào)節(jié)肽。

作為優(yōu)選：所述的步驟b）中，蛋白酶為胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解溫度為42℃、pH值為2、料液比為1:8—12 g/mL、時(shí)間為6—10 h、加酶量為1500—1600 u/g；

所述的步驟d）中，所述的凝膠柱層析和緩沖液洗脫是：PH8.5Tris-HC1 緩沖液，0 ～0.03mol/NaCl 梯度洗脫，收集有活性的各峰，凍干后，凝膠柱脫鹽；

所述的巨噬細(xì)胞來源于動(dòng)物的外周血、骨髓、組織，或經(jīng)體外誘導(dǎo)分化獲得；

所述的步驟e）中，所述反相高效液相色譜，即用RT-HPLC進(jìn)行純化，其色譜條件是: