[發明專利]一種小公魚免疫調節肽的制備方法

在審

• 申請號: 201810072882.0
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108396047A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 楊最素
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

1.一種小公魚免疫調節肽的制備方法，其特征在于所述的制備方法包括：選取原料小公魚進行酶解獲得小公魚蛋白肽，將獲得的小公魚蛋白肽作用于體外培養的巨噬細胞進行篩選酶解條件，通過分離純化獲得小公魚免疫調節肽產品。

2.根據權利要求1所述的小公魚免疫調節肽的制備方法，其特征在于所述的選取原料小公魚進行酶解獲得小公魚蛋白肽是：

a）將原料小公魚清洗后搗碎制成漿料，

b）酶解：選用蛋白酶對小公魚漿料進行酶解，制成酶解液；

c）超濾：將酶解液加入超濾系統，用10KD、5KD、3KD的超濾膜進行超濾，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液；

d）將酶解液用葡聚糖凝膠Sephadex G25進行凝膠柱層析和緩沖液洗脫，分別收集各峰后，將其作用于體外培養的巨噬細胞進行篩選酶解條件，獲得相應的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色譜(RT- HPLC)純化；

e）經過反相高效液相色譜(RT- HPLC)純化及氨基酸序列檢測，獲得小公魚免疫調節肽。

3.根據權利要求2所述的小公魚免疫調節肽的制備方法，其特征在于：

所述的步驟b）中，蛋白酶為胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解溫度為42℃、pH值為2、料液比為1:8—12 g/mL、時間為6—10 h、加酶量為1500—1600 u/g；

所述的步驟d）中，所述的凝膠柱層析和緩沖液洗脫是：PH8.5Tris-HC1 緩沖液，0 ～0.03mol/NaCl 梯度洗脫，收集有活性的各峰，凍干后，凝膠柱脫鹽；

所述的巨噬細胞來源于動物的外周血、骨髓、組織，或經體外誘導分化獲得；

所述的步驟e）中，所述反相高效液相色譜，即用RT-HPLC進行純化，其色譜條件是:

1)樣品前處理:將樣品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，離心12000-14000RPM，離心10分鐘后取上清；

2)系統: Agilent 1260 HPLC；

3)柱子:ZorbaxSB-C18 4.6X250 5um；

4)進樣體積:80-100ul；

5)緩沖液、平衡緩沖液: 0.06%TFA洗脫緩沖液: 0.05%TFA的乙腈；

6) 梯度:0%–0 % B洗脫4分鐘，0%–8% B洗脫25分鐘，8%-100%B洗脫1分鐘，100% -100%B洗脫5分鐘；

7)流速:1.0 ml/min；8）檢測:280nm/214nm。

4.根據權利要求3所述的小公魚免疫調節肽的制備方法，其特征在于：

所述的步驟d）中，所述的體外誘導分化是：將單個核細胞用添加有濃度為10—100μg/mL細胞因子的RPMI1604或TCM199完全培養液在36—38℃下培養1—10天，得到巨噬細胞；所述細胞因子為GM—CSF、M—CSF、IL—4和IL—6中的一種或幾種。