[發明專利]一種高通量篩選優質卵母細胞的方法

有效

• 申請號: 201810072343.7
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108004204B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 肖紅衛;張立蘋;華再東;任紅艷;李莉;華文君;畢延震;劉西梅;鄭新民;李會鋒
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 強紅剛

本發明提供了一種高通量篩選優質卵母細胞的方法，該方法首先通過成熟液Ⅰ和Ⅱ讓卵母細胞在體外培養環境達到成熟，再通過脫卵丘溶液進行脫卵丘細胞，同時對卵母細胞的細胞膜結構的完整性進行初選，半透膜結構不完整的卵母細胞不會出現卵周隙，在此過程中可以淘汰一部分劣質卵母細胞；最后在等滲無激素溶液中復選，如果初選的卵母細胞的細胞膜不能恢復到脫卵丘溶液處理之前的狀態，則這種卵母細胞也必須淘汰，從而可快速高通量篩選出優質卵母細胞，用于生產性克隆工作的開展。

技術領域

本發明屬于細胞工程技術領域，具體而言，涉及一種通過滲透壓處理技術高通量篩選優質卵母細胞的方法。

背景技術

目前，在核移植研究中，人們對所用的卵母細胞進行篩選的方法基本上只有如下兩種：第一種是盲選，不管什么質量的卵母細胞，直接做；第二種是用亮甲酚藍對卵母細胞染色，染上色的卵母細胞判斷為質量較好的，未染上色的卵母細胞判斷為質量不好的。文獻檢索披露：1.Theriogenology，68(2007)1299-1304作者：B.M.Manjunatha等，發表的《成熟前用亮甲酚藍選擇有發育潛力的水牛卵母細胞》文章內容是，將卵母細胞置于BCB染色液90分鐘，比較了不同濃度BCB對卵母細胞的選擇率；比較了經過選擇的陰陽性卵母細胞直徑的差別；比較了不同實驗組(對照組，空白組，陽性組，陰性組)成熟率，囊胚率，結果陽性組高于其他組。2.Theriogenology，63(2005)2194-2205，作者：H.Alm等發表的《成熟前用可以檢測G6PDH活性的亮甲酚藍選擇卵母細胞對牛體外囊胚發育率的影響》文章內容是，檢測了經過BCB染色的陰、陽性卵母細胞在G6PDH活性上的差別，陰性組G6PDH活性高于陽性組和實驗組。但陽性組體外成熟率、囊胚率高于其他組。3.Theriogenology，57(2002)1397-1409，作者：E.Rodriguez-Gonzalez等發表的《用亮甲酚藍選擇羔山羊卵母細胞》文章內容是，研究了不同濃度BCB染色液對羔山羊卵母細胞的選擇，比較經過選擇后的卵母細胞的體外受精率和成熟率，發現26μM濃度的染色液適合羔山羊卵母細胞的選擇。經過選擇后的陽性卵母細胞在細胞直徑，體外發育率等方面都顯著高于陰性卵母細胞。4.Theriogenology，61(2004)735-744，作者：MarcPujol等發表的《通過亮甲酚藍(BCB)選擇具有發育潛力的小母牛卵母細胞》文章內容是，研究了BCB染色液在用于體外胚胎生產的小母牛卵母細胞上的選擇作用。比較了陽性卵母細胞與對照組以及成年母牛之間發育潛力、卵母細胞直徑差異，結果表明：不同等級卵母細胞選擇率不同，陽性卵母細胞直徑大于陰性卵母細胞，陽性胚胎囊胚發育率高于陰性組和對照組，但低于成年母牛組。國內有關中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所喬利敏等8人發表的《亮甲酚藍染色對牛卵母細胞體外成熟及體外受精的影響》也將亮甲酚藍染色液用于牛卵母細胞的篩選等。顯然，第二種方法需要在培養基中添加染料并進行90min的培養，該方法操作較為復雜，并且篩選效率低，不利于大量生產性克隆工作的開展。

發明內容

鑒于有技術的不足，本發明的目的在于提供一種操作簡單方便的高通量篩選優質卵母細胞的方法，用以解決目前卵母細胞篩選效率低的問題。

為了實現本發明的目的，發明人結合多年來的科研經驗并不懈探索和努力，最終通過在胚胎操作過程中序貫使用不同滲透壓溶液，使卵母細胞在體外培養環境快速達到成熟，同時利用細胞的半透膜對滲透壓的反應來快速高通量篩選優質卵母細胞。具體地，本發明的技術方案概括如下：

一種高通量篩選優質卵母細胞的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

(1)將挑選的卵丘卵母細胞復合體移入成熟液Ⅰ中培養，所述的成熟液Ⅰ的組成為：TCM199+2.90～3.15mM葡萄糖+0.85～0.95mM丙酮酸鈉+0.52～0.60mML-半胱氨酸+90～110IU/mL青霉素+90～110μg/mL的硫酸鏈霉素+9％～11％卵泡液+9～11IU/mL PMSG+9～11IU/mLhCG；