[發明專利]一種高通量篩選優質卵母細胞的方法

有效

• 申請號: 201810072343.7
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108004204B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 肖紅衛;張立蘋;華再東;任紅艷;李莉;華文君;畢延震;劉西梅;鄭新民;李會鋒
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 強紅剛

1.一種高通量篩選優質卵母細胞的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（1）將挑選的卵丘卵母細胞復合體移入成熟液Ⅰ中培養，所述的成熟液Ⅰ的組成為：TCM199+ 2.90～3.15mM葡萄糖+ 0.85～0.95mM丙酮酸鈉+ 0.52～0.60mM L-半胱氨酸+ 90～110IU/mL青霉素+ 90～110μg/mL的硫酸鏈霉素+ 9%～11%卵泡液+ 9～11IU/mL PMSG+ 9～11IU/mL hCG；

（2）將步驟（1）培養后的卵丘卵母細胞復合體移入成熟液Ⅱ中培養，所述的成熟液Ⅱ的組成為：TCM199+ 2.90～3.15mM葡萄糖+ 0.85～0.95mM丙酮酸鈉+ 0.52～0.60mM L-半胱氨酸+ 90～110IU/mL青霉素+ 90～110μg/mL的硫酸鏈霉素+ 9%～11%卵泡液；

（3）將驟（2）培養的卵丘卵母細胞復合體移入脫卵丘溶液中，震蕩處理0.5-2min，然后轉移出現卵周隙的卵母細胞進行下一步操作，所述的脫卵丘溶液組成為：PVA-TL-Hepes+15～25mg/mL透明質酸酶+ 9～15mg甘露醇+ 0.15～0.30mg BSA；

（4）將驟（2）初選的卵母細胞移入等滲無激素溶液中洗滌，淘汰卵胞質膜不能恢復的卵母細胞，所述的等滲無激素溶液的組成為：TCM199+ 2.90～3.15mM葡萄糖+ 0.85～0.95mM丙酮酸鈉+ 0.52～0.60mM L-半胱氨酸+ 90～110IU/mL青霉素+ 90～110μg/mL的硫酸鏈霉素+ 19%～11%卵泡液+ 7～9mg/mL Hepes；

步驟（3）處理后選出卵周隙寬度為4-6μm的卵母細胞進行下一步操作。

2.根據權利要求1所述高通量篩選優質卵母細胞的方法，其特征在于，步驟（1）和步驟（2）的培養條件為：5%CO₂，飽和濕度，時間16-28h,溫度38-39℃。

3.根據權利要求1所述高通量篩選優質卵母細胞的方法，其特征在于，步驟（1）中所述的成熟液Ⅰ的組成為：TCM199+ 3.05mM葡萄糖+ 0.91mM丙酮酸鈉+ 0.57mM L-半胱氨酸+100IU/mL青霉素+ 100μg/mL的硫酸鏈霉素+ 10%卵泡液+ 10IU/mL PMSG+ 10IU/mL hCG。

4.根據權利要求1所述高通量篩選優質卵母細胞的方法，其特征在于，步驟（2）中所述的成熟液Ⅱ的組成為：TCM199+ 3.05mM葡萄糖+ 0.91mM丙酮酸鈉+ 0.57mM L-半胱氨酸+100IU/mL青霉素+ 100μg/mL的硫酸鏈霉素+ 10%卵泡液。

5.根據權利要求1所述高通量篩選優質卵母細胞的方法，其特征在于，步驟（3）中所述的脫卵丘溶液組成為：PVA-TL-Hepes+ 20mg/mL透明質酸酶+ 12mg甘露醇+ 0.2mg BSA。

6.根據權利要求1所述高通量篩選優質卵母細胞的方法，其特征在于，步驟（4）中所述的等滲無激素溶液的組成為：TCM199+ 3.05mM葡萄糖+ 0.91mM丙酮酸鈉+ 0.57mM L-半胱氨酸+ 100IU/mL青霉素+ 100μg/mL的硫酸鏈霉素+ 10%卵泡液+ 7.5mg/mL Hepes。