[發明專利]一種BHK-21細胞株及其培養方法和用途

在審

• 申請號: 201810071076.1
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108396006A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 鄭從義;桂哲;徐國東
• 申請（專利權）人: 武漢珈創生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 程殿軍;張瑾

本發明涉及一種能在多種無血清培養基中懸浮生長的BHK?21細胞株的培養方法，包括以下步驟：S1.復蘇BHK?21細胞系；S2.BHK?21細胞系的分選及克隆細胞培養擴增；S3.BHK?21克隆細胞群體的無血清懸浮培養。本發明還提供了能在多種無血清培養基中懸浮生長的BHK?21細胞株株及其用途。本發明所述的方法無需微載體作為附著載體，無需轉瓶維持滾動培養模式，培養基不含血清，無蛋白成分，是由無機鹽及營養物組成的CD級商業無血清培養基。此外，該無血清懸浮培養BHK?21細胞株可直接由無血清培養基添加DMSO凍存，復蘇時也可直接用無血清培養基復蘇。為工業級擴大生產病毒疫苗提供了新的思路與方法。

技術領域

本發明涉及一種動物細胞的培養方法，尤其涉及一種能在多種無血清培養基中懸浮生長的BHK-21細胞株的培養方法和用途。

背景技術

動物細胞的無血清懸浮培養一直是基因工程藥物和病毒疫苗規模化生產所追求的目標，但迄今成功的例子不多。CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)是最為成功的例子，它可以在數百升的容器中用無血清培養基連續懸浮培養2-3周，細胞生長的密度能達到10⁸個/ml，解決了細胞大量表達基因工程藥物和病毒的高效擴增的技術難題，該細胞已在全球的基因工程藥物(蛋白類藥物、多肽藥物、人源治療性單抗)規模化生產中廣泛應用。CHO細胞無血清培養基連續懸浮培養的成功，為建立動物細胞的無血清懸浮培養體系開辟了新的途經。

BHK-21細胞(敘利亞腎細胞)是包括腺病毒、單純皰疹病毒、呼腸孤病毒、水泡性口炎病毒、豬瘟病毒和口蹄疫病毒在內的很多病毒的理想宿主，通常這些病毒的培養及大量擴增，尤其是病毒疫苗生產均采用BHK-21細胞做宿主。由于BHK-21細胞為賴性生長細胞，需要加入一定量的動物血清細胞才能貼壁生長，常規懸浮培養幾乎不可能。因此，工業級用含有血清的培養基培養BHK-21細胞進行病毒的擴大生產時，主要利用園形轉瓶接種在轉瓶機上滾動培養，有限的轉瓶表面積制約了病毒產率的提高，為解決病毒產率較低的問題，研究者們研發了一種微載體細胞培養體系，讓細胞依附在微珠上生長再進病毒感染，以達到增加表面積提高病毒產率的目的，但效率仍不高。再者細胞貼壁培養時加入高濃度(10-15％)動物來源的血清會對下游病毒純化造成困難。長期以來，研究者借用CHO細胞無血清懸浮培養的馴化方法，試圖采用遞次降低血清濃度；添加生長因子、激素、氨基酸等營養物質進行無血清選擇；連續培養選擇等不同的方法馴化BHK-21細胞，改變細胞的培養狀態(懸浮培養)，使其用于疫苗的工業化生產，但尚末見成功的例子。可見，BHK-21細胞的確是一種非常難于馴化的細胞，在含有血清的培養基中趨向于貼壁生長，而不加血清的無血清培養基中就不生長，甚至在短期內死亡。看來，要成功建立無血清的細胞懸浮培養體系，需采用創新的策略。

單細胞分離技術有很多種，常用的有顯微鏡直接分離技術、磁珠分離技術、激光捕獲顯微切割技術、膜片鉗技術等，近年發展成熟的流式細胞儀分選技術可快速高效地行各種單細胞分離。本發明采用流式細胞儀分選技術分離單細胞結合飼養層方法篩選BHK-21克隆細胞群體，并用無血清培養基馴化克隆細胞群體，獲得3株能在無血清培養基中連續懸浮培養，且大規摸增殖的BHK-21懸浮培養細胞株；同時證明該細胞株能支撐口蹄疫病毒高效擴增，使應用BHK-21細胞為宿主大規摸擴增病毒成為可能。

發明內容

針對利用動物細胞生產疫苗的工業生產中存在的問題，本發明提供了一種BHK-21細胞的無血清懸浮培養方法，該方法利用流式細胞儀分選技術分離單細胞結合飼養層方法篩選BHK-21克隆細胞群體，并用無血清培養基馴化。

為此，本發明采取的技術方案如下：

一種能在多種無血清培養基中懸浮生長的BHK-21細胞株的培養方法，包括以下步驟：

S1.復蘇BHK-21細胞系