[發明專利]一種BHK-21細胞株及其培養方法和用途在審
| 申請號： | 201810071076.1 | 申請日： | 2018-01-25 |
| 公開（公告）號： | CN108396006A | 公開（公告）日： | 2018-08-14 |
| 發明（設計）人： | 鄭從義;桂哲;徐國東 | 申請（專利權）人： | 武漢珈創生物技術股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228 | 代理人： | 程殿軍;張瑾 |
| 地址： | 430075 湖北省武漢市東湖開發區高新大道*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 無血清培養基 細胞株 懸浮培養 無血清 復蘇 細胞培養 懸浮 克隆 無機鹽 病毒疫苗 附著載體 擴大生產 細胞群體 培養基 工業級 微載體 營養物 生長 血清 凍存 分選 擴增 轉瓶 蛋白 滾動 | ||
1.一種能在多種無血清培養基中懸浮生長的BHK-21細胞株的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：
S1.復蘇BHK-21細胞系；
S2.BHK-21細胞系的分選及克隆細胞培養擴增；
S3.BHK-21克隆細胞群體的無血清懸浮培養。
2.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟S1的所述復蘇BHK-21細胞系具體包括：
取出液氮罐中保藏的BHK-21細胞系，轉移至37℃的水浴鍋中于0-2分鐘內解凍，細胞溶解后接種到T25細胞培養瓶中，向其中添加7ml含有10％(v/v)胎牛血清的MEM培養基，輕輕吹打混勻，培養4-6hr后，移棄細胞培養基，換上新鮮的含10％(v/v)胎牛血清的MEM培養基，于37℃，5％(v/v)二氧化碳培養箱中培養2-3d，用于分選單個細胞。
3.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于，步驟S2的BHK-21細胞系的分選及克隆細胞培養擴增具體包括以下步驟：
(1)無菌操作從昆明小鼠腹腔中取出腹腔細胞，1000轉/min離心10min，棄上清，用新鮮的MEM培養基懸浮細胞，計數，調整細胞濃度為106個/ml，接種細胞至96孔細胞培養板中，0.1ml/孔；將該96孔細胞培養板置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培養箱中培養24-36hr，制備飼養層細胞，以得到含1.0％(v/v)胎牛血清的96孔飼養層細胞培養板；
(2)取步驟S1制備的BHK-21細胞系一瓶，棄培養上清，加入1.0ml，0.25％(W/V)胰酶以消化分散細胞，顯微鏡觀察，保證所有細胞處于單個分散細胞狀態；
(3)將分散的BHK-21細胞置于流式細胞儀中分選單個細胞，之后將分選的單個細胞直接接種到上述步驟(1)制得的96孔飼養層細胞培養板中，一個單細胞/孔；將該96孔飼養層細胞培養板置于37℃，5％(v/v)二氧化碳培養箱中培養2-3周；
(4)逐孔觀察該96孔飼養層細胞培養板中細胞的生長狀況，選擇生長良好的細胞克隆傳代到12孔細胞板中，細胞生長良好后轉移至T25培養瓶中擴增細胞，獲得遺傳背景一致的BHK-21克隆細胞群體，當細胞傳代培養達到5×107個細胞時，常規液氮凍存備用。
4.如權利要求3所述的培養方法，其特征在于，步驟(1)中的所述腹腔細胞主要包括巨噬細胞及其它免疫細胞。
5.如權利要求3所述的培養方法，其特征在于，步驟(2)中的所述BHK-21細胞系具有95％的融匯度。
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