[發明專利]一種低氧培養經血來源子宮內膜干細胞的方法

在審

• 申請號: 201810071059.8
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN110079496A
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 左鳳瓊;楊嘉潔
• 申請（專利權）人: 左鳳瓊
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種低氧培養經血來源子宮內膜干細胞的方法。該子宮內膜干細胞來源于成年女性經血，培養條件為1?10％的氧氣濃度(優選5％)，該方法具有制備簡便，易規模化生產，穩定性好等特點。與常氧培養條件下培養的子宮內膜干細胞相比，缺氧環境下低氧培養的子宮內膜干細胞具有更強的存活能力。

技術領域

本發明涉及干細胞技術領域，具體涉及一種經血來源子宮內膜干細胞的低氧培養的方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是一種多能干細胞，來源于發育早期的中胚層，因能分化為間質組織而得名，具有自我更新能力和多向分化能力，可用于造血支持和促進干細胞植入及免疫調控等多種功能。

子宮內膜干細胞具有高度的分化潛能、增殖能力以及較低的免疫原性，作為免疫調節劑可減輕炎癥，在動物試驗中顯示其在保護結腸免受大腸炎侵害方面有獨特的作用，在組織重構和組織工程中促進血管再生和血管形成，表現出優于臍帶MSC的作用，在心臟病動物模型中，子宮內膜干細胞的治療已經具有顯著性的效果。子宮內膜干細胞與與骨髓間充質干細胞(BMSC)比較更能抑制混合淋巴細胞反應中細胞的增殖。在動物模型中移植子宮內膜干細胞之后還沒有畸胎瘤、異常組織形成、免疫排斥等反應發生。

子宮是一個具有高度再生及分化能力的組織，每個月經周期，女性的子宮內膜從0.5mm左右增厚到5-7mm左右。子宮內膜中含有具有高度增殖能力的干細胞。子宮內膜干細胞的直接獲得途徑比如子宮切除術、早起妊娠脫膜、刮除術均對供者具有嚴重侵入性；經血隨月經周期每月排出，通過搜集經血，分離增殖出子宮內膜干細胞這種無創傷的方式是獲得子宮內膜干細胞的最佳方式。從經血中分離出的子宮內膜干細胞我們稱為經血來源子宮內膜干細胞(Menstrual blood-derived endomentrium Stem Cells，MenESCs)。

體內細胞所處的微環境是低氧或者缺氧的，在骨髓、脂肪等組織中，氧氣濃度極低，一般為1-8％。而目前一般子宮內膜干細胞體外擴增培養的條件是O₂濃度為21％，氧濃度含量高，體外培養過程中子宮內膜干細胞所處的微環境與其來源的組織微環境存在較大差異。由于子宮內膜干細胞在再生醫學領域具有巨大的應用潛能，為了在體外培養的過程中模擬體內的環境以避免子宮內膜干細胞體內應用時細胞性質、功能發生改變，本發明采用了低氧條件進行經血來源子宮內膜干細胞的培養。

本發明采用在體外低氧培養經血子宮內膜干細胞，制備簡便，易規模化生產，并且經過凍存、復蘇處理后能維持較高的穩定性，與普通培養(常氧)條件下培養的子宮內膜干細胞相比，低氧培養子宮內膜干細胞在缺氧環境下具有更強的生存能力。

發明內容

基于以上背景，本發明提供一種低氧培養經血來源子宮內膜干細胞的方法。本發明提供的子宮內膜干細胞來源于人月經血，培養條件為低氧(1-10％)。

所述經血來源子宮內膜干細胞制備方式：

(1)標本保存液的配制：PBS緩沖液，分別加入終濃度200U/ml的慶大霉素，0.2mg/ml的兩性霉素，1.0mg/ml的EDTA-NA₂。充分混勻。

(2)經血采集：收集健康女性(20-50歲)捐贈的經期第2-3天經血樣本約10ml。經血樣本收集后立即轉移至裝有10ml標本保存液的50ml離心管中，輕輕混勻。

(3)經密度梯度離心法分離子宮內膜干細胞。

(4)培養基配制：低糖DMEM與F12按比例混合后加入終濃度為10％的替代血漿，加入慶大霉素(終濃度為100U/ml)、兩性霉素(終濃度為0.1mg/ml)。

(5)將細胞接種于T25培養瓶中，加入配制好的完全培養基，吹打混勻，并進行細胞計數。

(6)待細胞的融合率達到80％以上時，用胰蛋白酶消化，并離心收集細胞；