[發明專利]基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環境污染物發育毒性的方法

在審

• 申請號: 201810068199.X
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108401978A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 張穎;施華宏;王魯梅;葉璟
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02
• 代理公司: 上海藍迪專利商標事務所(普通合伙) 31215
• 代理人: 徐筱梅;張翔

1.一種基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環境污染物發育毒性的方法，其特征在于，該方法包括以下具體步驟：

步驟1：挑選發育階段均一、健康的熱帶爪蟾胚胎；

步驟2：將環境污染物按照等比梯度配制成不同濃度的系列暴露液；

步驟3：將健康的熱帶爪蟾胚胎置于步驟2的系列暴露液中，在25℃恒溫培養箱中連續培養48-72小時；

步驟4：連續采集15分鐘內的蝌蚪運動視頻，將蝌蚪運動軌跡可視化，測定包括運動距離、平均速度運動、最大運動速度的運動行為參數；

步驟5：采用方差分析對各暴露組與對照組的運動行為參數進行比較，根據檢驗結果的顯著性水平判斷是否具有發育毒性，根據相對運動距離與相對運動速度判斷發育毒性程度。

2.根據權利要求1所述的基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環境污染物發育毒性的方法，其特征在于，所述步驟1具體包括：采用人工注射人絨毛膜促性腺激素的方法誘導熱帶爪蟾抱對產卵，在顯微鏡下挑選來自同一親本、處于原腸胚早中期、發育正常的熱帶爪蟾胚胎，置于林格氏液中備用。

3.根據權利要求1所述的基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環境污染物發育毒性的方法，其特征在于，所述步驟2中，環境污染物是殺蟲劑、除菌劑；將待測污染物溶于水中，再按比例用林格氏液依次等比稀釋成所需的濃度梯度系列暴露液；難溶于水的待測污染物先使用助溶劑等比梯度稀釋，再取污染物溶液混入林格氏液中，配制成所需濃度的系列暴露液，系列暴露液中助溶劑的終濃度為0.1%；系列暴露液現配現用，其中最高濃度為半致死濃度的50%，稀釋比例為1/5-1/2。

4.根據權利要求1所述的基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環境污染物發育毒性的方法，其特征在于，所述步驟3具體包括：將挑選的熱帶爪蟾胚胎隨機分成多個暴露組，分別標記為暴露組1—暴露組n及對照組；對照組使用林格氏液，難溶于水的污染物的對照組使用含0.1%助溶劑的林格氏液；將胚胎置于恒溫培養箱中，25℃、黑暗條件下連續培養，24小時更換暴露液，挑除死亡的胚胎。

5.根據權利要求1所述的基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環境污染物發育毒性的方法，其特征在于，所述步驟4具體包括：暴露結束后，將存活的蝌蚪轉移至48孔板中，每孔放置一條蝌蚪，加入對應的污染物暴露液或林格氏液500μL；待蝌蚪在48孔板中適應2分鐘后，利用CCD相機連續采集記錄光照條件下、15分鐘內的蝌蚪運動視頻，相機幀速率應大于30幀/s，圖像大小大于640像素*480像素；應用行為分析系統將每條蝌蚪的運動軌跡可視化，獲取運動距離、平均速度運動、最大運動速度的行為參數的定量結果。

6.根據權利要求1所述的基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環境污染物發育毒性的方法，其特征在于，所述步驟5具體包括：將各暴露組與對照組的運動參數進行方差分析，根據組間比較的顯著性水平判斷污染物是否具有發育毒性，并根據運動距離、運動速度的變化倍數來判斷環境污染物引起的發育毒性程度。