[發(fā)明專利]基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環(huán)境污染物發(fā)育毒性的方法

在審

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• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108401978A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張穎;施華宏;王魯梅;葉璟
• 申請（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02
• 代理公司: 上海藍(lán)迪專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 31215
• 代理人: 徐筱梅;張翔

本發(fā)明公開了一種基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環(huán)境污染物發(fā)育毒性的方法，該方法包括以下步驟：挑選發(fā)育階段均一、健康的熱帶爪蟾胚胎；將環(huán)境污染物按照等比梯度配制成不同濃度的系列暴露液；將胚胎置于環(huán)境污染物暴露液中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48?72小時；連續(xù)采集15分鐘內(nèi)的蝌蚪運動視頻，將運動軌跡可視化，測定包括運動距離、平均速度運動、最大運動速度的運動行為參數(shù)；采用方差分析對各暴露組與對照組的運動行為參數(shù)進(jìn)行比較，根據(jù)檢驗結(jié)果判斷污染物是否具有發(fā)育毒性及發(fā)育毒性程度；通過熱帶爪蟾蝌蚪的定量化運動行為參數(shù)簡單、快速、靈敏地評價環(huán)境污染物的發(fā)育毒性，可作為污染水樣生物毒性的補充檢測指標(biāo)，為水體中環(huán)境污染物的潛在生態(tài)風(fēng)險提供參考依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及環(huán)境污染物的發(fā)育毒性評價技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環(huán)境污染物發(fā)育毒性的方法。

技術(shù)背景

當(dāng)今全球性兩棲動物種群衰退現(xiàn)象非常嚴(yán)重，而環(huán)境污染物正是兩棲動物種群衰退甚至滅絕的直接原因之一。兩棲動物通常在水環(huán)境中完成繁殖和幼體發(fā)育過程，且兩棲動物的卵極易吸收有機污染物，因此其幼體發(fā)育過程很有可能受到水中環(huán)境污染物的干擾。大量研究已發(fā)現(xiàn)重金屬、農(nóng)藥等環(huán)境污染物能對兩棲動物早期發(fā)育造成毒性效應(yīng)，并持續(xù)作用于生長發(fā)育過程，導(dǎo)致兩棲動物種群數(shù)量大量減少。這就要求必須重視環(huán)境污染物對兩棲動物的發(fā)育毒性，開發(fā)簡單有效的方法對環(huán)境污染物的發(fā)育毒性進(jìn)行評估。

目前對環(huán)境污染物的兩棲動物發(fā)育毒性研究主要采用非洲爪蟾胚胎致畸試驗（The Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus，F(xiàn)ETAX），即將發(fā)育早期的非洲爪蟾胚胎在化學(xué)品溶液中暴露96h，通過檢測胚胎死亡率、畸形率和致畸指數(shù)等來評價化學(xué)品的發(fā)育毒性。然而，導(dǎo)致胚胎死亡或畸形的化學(xué)品濃度通常比較高，與實際環(huán)境殘留量不相符，而環(huán)境相關(guān)濃度下的污染物常常不會引起顯著的爪蟾胚胎死亡或畸形。這使得非洲爪蟾胚胎致畸試驗無法完全滿足低濃度環(huán)境污染物所引起的發(fā)育毒性評價的需求。因此，為了評價實際環(huán)境污染物所引起的發(fā)育毒性和生態(tài)風(fēng)險，開發(fā)一種能夠快速、敏感地反映貼近環(huán)境真實濃度的污染物發(fā)育毒性的檢測方法顯得尤為必要。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺點，本發(fā)明的目的是提供一種基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環(huán)境污染物發(fā)育毒性的方法，可以簡單、快速、靈敏地定量評估環(huán)境污染物的發(fā)育毒性。

本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種基于熱帶爪蟾蝌蚪運動行為檢測環(huán)境污染物發(fā)育毒性的方法，該方法包括以下具體步驟：

步驟1：挑選發(fā)育階段均一、健康的熱帶爪蟾胚胎；

步驟2：將環(huán)境污染物按照等比梯度配制成不同濃度的系列暴露液；

步驟3：將健康的熱帶爪蟾胚胎置于環(huán)境污染物系列暴露液中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48-72小時；

步驟4：連續(xù)采集15分鐘內(nèi)的蝌蚪運動視頻，將蝌蚪運動軌跡可視化，測定包括運動距離、平均速度運動、最大運動速度的運動行為參數(shù)；

步驟5：采用方差分析對各暴露組與對照組的運動行為參數(shù)進(jìn)行比較，根據(jù)檢驗結(jié)果的顯著性水平判斷是否具有發(fā)育毒性，根據(jù)相對運動距離和相對運動速度判斷發(fā)育毒性程度。

所述步驟1具體包括：采用人工注射人絨毛膜促性腺激素的方法誘導(dǎo)熱帶爪蟾抱對產(chǎn)卵，在顯微鏡下挑選來自同一親本、處于原腸胚早中期、發(fā)育正常的熱帶爪蟾胚胎，置于林格氏液中備用。