[發明專利]一種利用巨大芽孢桿菌制備亞油酸的方法

有效

• 申請號: 201810067168.2
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108004277B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 李祝;吉玉玉;楊龍;肖洋;張素
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12P7/64
• 分類號: C12P7/64;C12N1/20;C12R1/11
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標事務有限公司 52002
• 代理人: 袁慶云

1.一種利用巨大芽孢桿菌制備亞油酸的方法，包括：

（1）菌種活化

將巨大芽孢桿菌L2菌株接于NA固體斜面培養基上，30±1℃靜置培養48h，活化3次，保存于4℃冰箱備用；

（2）種子液的制備

將活化的巨大芽孢桿菌L2菌株利用接種環刮取兩環接種于250mL NB液體種子培養基中，30±1℃，130-150 r/min，搖瓶培養20-24h，得種子液；

（3）發酵培養

取種子液按體積比6%接種于250mL NB發酵培養基中，30±1℃，130-150 r/min，培養3天終止發酵，發酵液在5000-6000 r/min、4℃下離心15-20min，進行菌液分離，除去發酵液，收集菌體細胞；

（4）浸膏的制備

取上述所得菌體細胞置于鼓風干燥箱中，50-55℃烘至恒重，磨粉，過50-60目篩得菌粉，用乙酸乙酯萃取，減壓回收溶劑，得到供試樣品乙酸乙酯部分和水部分，并將乙酸乙酯部分旋蒸濃縮得到浸膏；

（5）分離

取乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱層析，按石油醚：乙酸乙酯體積比為100:1,50:1,20:1，10:1,5:1,2:1,1:1，乙酸乙酯：甲醇體積比為30:1,20:1,10:1,5:1,2:1,1:1，純甲醇體系沖柱，薄層紫外254nm檢測，分為LE1-16的16個部分，選取極性適中的LE4，再次進行硅膠柱層析，按石油醚：乙酸乙酯體積比為60:1,40:1沖柱，薄層紫外254nm檢測，分為LE4-1-LE4-7的7個部分，取油狀物質LE4-5組分進行GC-MS分析，為脂肪酸類成分；

其中：巨大芽孢桿菌L2菌株保藏號：CCTCC NO：M2012381，名稱為：巨大芽孢桿菌L2（Bacillus megaterium L2）。

2.如權利要求1所述的一種利用巨大芽孢桿菌制備亞油酸的方法，其中NA固體斜面培養基的制備方法如下：蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 ml，pH 7.0-7.2；滅菌條件：121℃，15-20min。

3.如權利要求1或2所述的一種利用巨大芽孢桿菌制備亞油酸的方法，其中NB液體種子培養基的制備方法如下：蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，氯化鈉5 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1000 ml，pH 7.0-7.2；滅菌條件：121℃，15-20min。

4.如權利要求3所述的一種利用巨大芽孢桿菌制備亞油酸的方法，其中NB發酵培養基的制備方法如下：葡萄糖15 g/L，蛋白胨25 g/L，牛肉膏4.58 g/L，氯化鈉3.23 g/L，蒸餾水1000 ml，pH值為7.0-7.2；滅菌條件：121℃，15-20min。