[發明專利]貓杯狀病毒熒光免疫層析檢測試紙條及其制備方法

在審

• 申請號: 201810067151.7
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108362877A
• 公開（公告）日: 2018-08-03
• 發明（設計）人: 吳培星;韓濤;宋楠;付軍權;李純玲;張繼瑜
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所;北京天之泰生物科技有限公司;北京天恩泰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/533
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

1.一種貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)熒光免疫層析檢測試紙條，其特征在于：

包括背襯以及在背襯上依次設置的結合墊、層析膜以及吸水墊，構成可使樣品從結合墊層析到吸水墊的層析路徑；

所述結合墊上結合有熒光微球標記抗體復合物；所述層析膜上設置有與所述層析路徑垂直的檢測線和對照線；

所述熒光微球標記抗體復合物是熒光微球與兔抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗體的偶聯物；

所述檢測線由羊抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗體包被而成,所述對照線由葡萄球菌蛋白(Staphylococal Protein A，SPA)包被而成；

所述熒光微球粒徑為180-240nm。

2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于，所述結合墊上，所述熒光微球標記抗體復合物的包被密度：以兔抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗體質量計為7.5ug/每平方厘米。

3.根據權利要求2所述的試紙條，其特征在于，所述熒光微球標記抗體復合物是通過如下步驟制備而得：將熒光微球與兔抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗體以2～6mg：1～3mg的比例，優選2～5mg:1mg，2～4mg:1mg或3mg:1mg的比例，進行偶聯反應制得。

4.根據權利要求3所述的試紙條，其特征在于，所述熒光微球標記抗體復合物是通過如下步驟制備而得：向pH5.0，濃度0.02mol/L的PBS溶液中依次加入所述熒光微球、加入濃度為10mg/ml的EDC溶液，再加入兔抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗體，室溫下緩慢攪拌2h，加入終濃度為2％的BSA溶液封閉30min后，以10000r/min、4℃離心10min，移出上清液，所得沉淀中即含有所述熒光微球標記抗體復合物。

5.根據權利要求3所述的試紙條，其特征在于，所述熒光微球的粒徑210nm。

6.根據權利要求1-5任一所述的試紙條，其特征在于，所述熒光微球為稀土銪熒光微球。

7.根據權利要求1-5任一所述的試紙條，其特征在于，所述試紙條寬度為3mm，所述檢測線和對照線的寬度也為3mm；所述檢測線上，所述的羊抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗體包被量為0.5ug/條,所述的葡萄球菌蛋白包被量為0.3ug/條；優選地，檢測線和對照線相距5mm。

8.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于，

所述結合墊的上游還設置有樣品墊；用于接收樣品，并將樣品中的物質輸送到結合墊上；

優選地，還包括外殼，所述外殼對應所述樣品墊的位置有開口，對應檢測線和質控線的位置設置為透明或開口結構。

9.權利要求1-8任一所述的貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)熒光免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于，包括

制備所述熒光微球標記抗體復合物：將熒光微球與兔抗貓杯狀病毒(Felinecalicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗體以2～6mg：1～3mg的比例，優選2～5mg:1mg，2～4mg:1mg或3mg:1mg的比例，進行偶聯反應；

將熒光微球標記抗體復合物溶液以5ul/cm噴在結合墊上，真空抽干；

將結合墊，層析膜，吸水墊依次裝配到試紙條底襯上。

10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，還包括將濃度為2mg/ml的羊抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗體和濃度為1mg/ml的葡萄球菌蛋白分別包被在層析膜上,形成相距5mm的所述檢測線和所述對照線；

優選地，所述熒光微球標記抗體復合物的制備步驟如下：向pH5.0，濃度0.02mol/L的PBS溶液中依次加入所述熒光微球、加入濃度為10mg/ml的EDC溶液,再加入兔抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗體,室溫下緩慢攪拌2h，加入終濃度為2％的BSA溶液封閉30min后，以10000r/min、4℃離心10min，移出上清液，所得沉淀中即含有所述熒光微球標記抗體復合物；

優選地，在將所述熒光微球標記抗體復合物碰到結合墊之前，先采用pH8.2，含2％吐溫的濃度為0.05M的硼酸緩沖溶液浸泡處理結合墊；

優選地，還包括制備兔抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白多克隆抗體：用純化的貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)F蛋白免疫家兔,采血并分離血清,FCV F-ELISA檢測抗體效價,若效價達到1:5000以上,通過頸動脈放血,分離血清,滅活后用抗體純化柱對多克隆抗體進行純化,用PBS稀釋至1mg/ml；

優選地，還包括羊抗貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)多克隆抗體的制備:用純化的貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV)免疫綿羊,經耳靜脈采血并分離血清,用FCV-ELISA檢測抗體效價,若效價達到1:5000以上,通過頸動脈放血,分離血清,滅活后用抗體純化柱對多克隆抗體進行純化,用PBS稀釋至2mg/ml。