[發(fā)明專利]一種快速檢測抗性雜草的Ile-2041-Asn突變的分子檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810066606.3
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108048534A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周鳳艷;張勇;沈艷;王梅;高同春
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6895
• 代理公司: 合肥國和專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34131
• 代理人: 孫永剛

本發(fā)明公開了一種快速檢測抗性雜草的Ile?2041?Asn突變的分子檢測方法，基于LAMP技術(shù)快速鑒定，可用于含有改中突變的棒頭草的早期預(yù)警和流行監(jiān)測。該檢測方法共分為3個主要步驟：1)分別提取待測樣品的基因組DNA；2)設(shè)計特異性引物，進(jìn)行LAMP恒溫擴(kuò)增；3)在上述LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料或瓊脂糖凝膠電泳上分離，觀察擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)結(jié)果鑒定是否為具有Ile?2041?Asn突變的棒頭草種群。本發(fā)明實現(xiàn)了恒溫擴(kuò)增，不需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過程，使檢測時間和成本大大降低。與普通PCR相比，本發(fā)明還具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測準(zhǔn)確性高等特點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測抗性雜草的Ile-2041-Asn突變的分子檢測方法和制備方法。

背景技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增反應(yīng)(LAMP)是2000年由日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，該方法利用一套(4種)特異性引物，以識別靶基因的六個特定區(qū)域。該技術(shù)原理是：在Bst大片段聚合物的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60～65℃范圍60min內(nèi)，大量合成目標(biāo)DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物——白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。SYBR GreenⅠ是一種熒光染料，根據(jù)反應(yīng)液中成分的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性(沒有擴(kuò)增產(chǎn)物)時為橙色，陽性(有擴(kuò)增產(chǎn)物)時為綠色。LAMP的方法優(yōu)勢是在恒溫條件下進(jìn)行，不需要PCR儀等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng)極快，一般在1小時內(nèi)完成；擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，通過肉眼即可判定結(jié)果，不需要繁瑣的電泳過程；靈敏度高、特異性強(qiáng)；操作簡便、快捷，適于抗性雜草突變情況的快速診斷及檢測。

棒頭草(Polypogon fugax)是我國范圍內(nèi)普遍存在的一年生雜草，其生活史與冬季作物(如小麥和油菜)相似，并逐漸侵入農(nóng)田，可使這些作物產(chǎn)量和質(zhì)量顯著下降。

乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑類除草劑，如精噁唑禾草靈、炔草酯等常用于包括棒頭草在內(nèi)的小麥、油菜田禾本科雜草的防除，且此類除草劑中的一種藥劑若對雜草產(chǎn)生了抗性，往往其它藥劑也會表現(xiàn)出抗性，盡管這些藥劑并未在該區(qū)域施用。炔草酯是防止麥田類禾本科雜草的主導(dǎo)藥劑，目前在小麥田大面積推廣應(yīng)用。在生產(chǎn)上發(fā)現(xiàn)長期單一使用炔草酯，其用藥量逐年增加，藥效降低，雜草對炔草酯逐漸產(chǎn)生抗性。

經(jīng)過本研究團(tuán)隊多年跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)帶有Ile-2041-Asn突變的抗炔草酯的棒頭草種群。但經(jīng)檢索，目前國內(nèi)外尚未有對抗炔草酯棒頭草的Ile-2041-Asn突變的LAMP快速分子檢測的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提出了一種快速檢測抗性雜草的Ile-2041-Asn突變的分子檢測方法，經(jīng)本研究團(tuán)隊多年跟蹤調(diào)查，發(fā)現(xiàn)帶有Ile-2041-Asn突變的抗炔草酯的棒頭草種群。為了能夠及時控制田間抗性棒頭草種群的蔓延及指導(dǎo)田間農(nóng)民正確用藥，以LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)能夠快速檢測抗炔草酯棒頭草的Ile-2041-Asn突變情況，該方法具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點。本申請克服已有的抗炔草酯棒頭草Ile-2041-Asn突變的鑒定及檢測方法中存在費時、費力、成本高、準(zhǔn)確性低的缺點，提供一種具有簡便、快速、省時省力、靈敏度高的檢測方法，從而大大提高檢測效率，且由于ACCase基因的高保守性，在多個禾本科雜草中(如菵草、看麥娘等)基因序列同源性高，因此該檢測方法同樣適用于長期施用乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑的禾本科雜草。本申請根據(jù)含有Ile-2041-Asn突變的抗炔草酯的棒頭草基因型，優(yōu)化反應(yīng)條件，能對含有該突變的棒頭草葉片進(jìn)行檢測，可以及時發(fā)現(xiàn)該突變是否存在于田間，從而指導(dǎo)正確田間用藥，及時控制含有該種突變的棒頭草種群的蔓延，可以減少農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)損失，具有很強(qiáng)的實用價值。

本發(fā)明的一種快速檢測抗性雜草的Ile-2041-Asn突變的分子檢測方法，基于LAMP技術(shù)對該突變進(jìn)行快速鑒定，包括以下步驟：

(1)分別提取待測樣品的基因組DNA；

(2)運用特異性引物進(jìn)行LAMP恒溫擴(kuò)增；