[發明專利]用于鑒別沙門氏菌和單增李斯特菌的檢測分析方法

在審

• 申請號: 201810066077.7
• 申請日: 2018-01-23
• 公開（公告）號: CN108034692A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 姜川
• 申請（專利權）人: 麗水市食品藥品與質量技術檢驗檢測院
• 主分類號: C12Q1/10
• 分類號: C12Q1/10;C12Q1/04;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種用于鑒別沙門氏菌和單增李斯特菌的檢測分析方法，其包括以下步驟：(1)樣品的制備；(2)樣品的測定：采用近紅外光譜儀對沙門氏菌、單增李斯特菌的各組分進行近紅外光譜透射掃描；(3)數據處理：將處理后的光譜數據利用主成分分析法PCA法進行數據的處理，選取前兩個主成分的得分值，并采用分析軟件OPUS 6.5中主成分分析法對光譜數據進行分析。本發明通過測定沙門氏菌、單增李斯特菌等致病菌的近紅外光譜圖，利用基于主成分分析技術的投影判別對光譜數據進行分析，結果表明，不論是利用全細胞、細胞壁還是細胞質的近紅外光譜分析，都可以通過本發明的方法將沙門氏菌和單增李斯特菌區分開來。

技術領域

本發明屬于食品檢測技術領域，具體涉及一種用于鑒別沙門氏菌和單增李斯特菌的檢測分析方法。

背景技術

沙門氏菌是一種人畜共患和食源性疾病的致病菌。人畜感染后可呈無癥狀帶菌狀態，也可表現為有臨床癥狀的致死疾，它可能加重病態或死亡率，或者降低動物的繁殖生產力。自19世紀后期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法都是建立在采取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎上。此后的60年間，用于從食品中分離沙門氏菌的方法實質上與那些用于從臨床病料中分離沙門氏菌的方法是相同的。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4～7d才能完成。

單核細胞增生李斯特菌也是一種人畜共患病的病原菌。感染后主要表現為敗血癥、腦膜炎和單核細胞增多。單增李斯特菌在各年齡段人群中均可發病，尤其免疫機能低下者和新生兒、孕婦、老年人等，病死率為20％～30％。應用常規方法檢驗耗時費力，程序復雜。采用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測，也需要24h才能完成檢測過程，但仍然滿足不了實時檢測的需要。

進入90年代，近紅外分析技術逐步受到分析化學家的重視，應用逐步擴展到石油化工、醫藥、生物化學、煙草、紡織品等領域，現已發展成為一種獨立的分析技術活躍在光譜分析領域。傅立葉變換近紅外光譜(FTNIR)分辨率高，不僅能提供分子基團特征的振動吸收譜帶，而且能敏銳地探測分子基團及周圍環境的變化。細胞的近紅外光譜能夠反映核酸、蛋白質、糖蛋白和生物膜等分子在細胞內的含量、構型、構象及其所發生的變化。本工作通過建立其近紅外光吸收模型，找到食品中穩定期的沙門氏菌、單增李斯特菌的近紅外特征吸收光譜，使得不同致病菌能夠區分開來。

發明內容

為克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種用于鑒別沙門氏菌和單增李斯特菌的檢測分析方法，使有害微生物的檢測更加靈敏、簡便、快速。

用于鑒別沙門氏菌和單增李斯特菌的檢測分析方法，包括以下步驟：

(1)樣品的制備：

選擇對數期的沙門氏菌全細胞制備懸液，以轉速3 000r.min-1離心分離濕菌體，以無菌水分三次洗滌沉淀部分，充分振蕩搖勻使菌體分散開來，平板菌落計數法進行菌落計數，另用移液槍移取1mL菌液于大試管中，加入9mL無菌水，充分振蕩搖勻形成10倍稀釋菌懸液，然后逐級進行19次10倍稀釋，制成一組20個濃度梯度的沙門氏菌全細胞懸液，濃度梯度值呈比差為10的等差序列，備用；一組20個濃度梯度的單增李斯特氏菌全細胞懸液的制備同沙門氏菌全細胞懸液制備過程；

用超聲波細胞粉碎儀破碎沙門氏菌的全細胞，以轉速15 000r.min-1離心分離，沉淀部分為細胞壁、上清液為細胞質，將細胞質懸液充分振蕩搖勻，用移液槍移取1mL菌液于大試管中，加入9mL無菌水，充分振蕩搖勻形成10倍稀釋菌懸液，然后逐級進行19次10倍稀釋過程，制成一組濃度梯度的沙門氏菌細胞質懸液，20個濃度梯度值呈比差為10的等差序列，備用；一組20個濃度梯度的單增李斯特氏菌細胞質懸液的制備同沙門氏菌細胞質懸液制備過程；

一組20個濃度梯度的沙門氏菌細胞壁懸液的制備同沙門氏菌細胞質懸液制備過程；一組20個濃度梯度的單增李斯特氏菌細胞壁懸液的制備同單增李斯特氏菌細胞質懸液制備過程；