[發明專利]一種子宮內膜干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 201810065994.3
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN107988148A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 曹毓琳;劉俊江;時兆田;白志惠
• 申請（專利權）人: 北京臻溪谷醫學研究中心（有限合伙）
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 王玉松

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，特別涉及一種子宮內膜干細胞的分離培養方法。

背景技術

人類子宮內膜功能層在月經周期手提內激素的作用發生周期性的增生和脫落，早年即有學者提出子宮內膜顯著的增生能力可能源于子宮內膜干細胞的存在，大量的臨床觀察和基礎研究均顯示，子宮內膜干細胞可能成為子宮內膜過薄和內膜病變患者進行內膜修復替代治療的手段，同時可為內膜異位癥、子宮內膜癌等提供新的研究思路；子宮作為人體中具有超強再生能力的器官，其子宮內膜在么個月經周期中會增長約5-7cm，而以這種增長速率，子宮內膜會在婦女育齡期經過500次左右有規律的脫落和再生過程，同時，經血的獲得不具有侵入性，不會對供者造成傷害，來源廣泛，且對其研究不會涉及倫理道德和法律問題，此外，還具有采集方便等特性，因此成為尋找子宮內膜干細胞的新來源及提高臨床應用效果的研究熱點。

使用常規手段分離經血內的子宮內膜干細胞主要存在以下問題：1分離液使用量大，離心后部分紅細胞仍然懸浮在分離液中，致使收集到的細胞中混雜較多的紅細胞，制得的子宮內膜干細胞純度差；2.紅細胞層內也混雜有子宮內膜干細胞，致使細胞收率較低；3.較長時間的離心對細胞的活性造成損傷；4.經血樣本向本外周血樣本較為復雜，存在較多粘液物質及大量血凝塊，雜質較多；5.子宮內膜干細胞使用培養基成分較多，價格昂貴，且體外培養10代以上，細胞容易出現衰老、退化的現象，增殖效率低，且在培養基中添加較多的細胞生長因子，會促進干細胞分化，對于維持其感性與穩定性不利，影響干細胞儲存于研究質量。

發明內容

針對以上人子宮內膜干細胞分離過程中存在的大量問題，本發明提供了一種子宮內膜干細胞的分離培養方法，該方法分離培養的子宮內膜干細胞純度高，傳代培養15代后細胞活率依然高達94.5％，同時，該方法培養得到的子宮內膜干細胞污染率低，多次傳代后的干細胞具有多向分化的潛能。

本發明具體技術方案如下：

一種子宮內膜干細胞分離培養方法，該方法包括以下步驟：

1)采集經血樣本；

2)子宮內膜干細胞的分離：取100-200重量份的步驟1)采集的經血樣本，與20-40重量份的濃度為0.9％的氯化鈉注射液混合均勻，放置于多功能振蕩器上振搖20-30min，加入淋巴細胞分離液，離心，得到四層分離液，吸出底層分離液，即得A液，去除頂層透明液體，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均勻，將混合液倒入離心管中，將離心管放置于離心機中離心6-8min，棄上清，取沉淀，即得B液，將A液和B液用同體積的PBS緩沖液洗滌，過200μm細胞篩網，收集子宮內膜干細胞；

3)子宮內膜干細胞的原代培養：將步驟2)分離得到的子宮內膜干細胞進行原代培養，得原代培養細胞。

其中，HES為羥乙基淀粉，消化酶為任意一種消化酶，如胃蛋白酶等。

進一步改進，步驟3)具體包括以下步驟：

3)子宮內膜干細胞的培養：將步驟2)收集的子宮內膜干細胞接種到原代培養基上進行原代培養，培養條件為：將原代培養基放置于37±1℃，體積分數為5％CO₂的飽和濕度的培養箱中，培養的前兩天每天向培養基中添加濃度為2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待細胞融合至85％-90％，即得原代培養細胞；其中，所述原代培養基為包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化鎂、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培養基。