[發明專利]一種子宮內膜干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 201810065994.3
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN107988148A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 曹毓琳;劉俊江;時兆田;白志惠
• 申請（專利權）人: 北京臻溪谷醫學研究中心（有限合伙）
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A01N1/02
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙)11419
• 代理人: 王玉松

1.一種子宮內膜干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1)采集經血樣本；

2)子宮內膜干細胞的分離：取100-200重量份的步驟1)采集的經血樣本，與20-40重量份的濃度為0.9％的氯化鈉注射液混合均勻，放置于多功能振蕩器上振搖20-30min，加入淋巴細胞分離液，離心，得到四層分離液，吸出底層分離液，即得A液，去除頂層透明液體，再加入1-2重量份的HES和1.5-2.5重量份的消化酶混合均勻，將混合液倒入離心管中，將離心管放置于離心機中離心6-8min，棄上清，取沉淀，即得B液，將A液和B液用同體積的PBS緩沖液洗滌，過200μm細胞篩網，收集子宮內膜干細胞；

3)子宮內膜干細胞的原代培養：將步驟2)分離得到的子宮內膜干細胞進行原代培養，得原代培養細胞。

2.如權利要求1所述的子宮內膜干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟3)具體包括以下步驟：

3)子宮內膜干細胞的培養：將步驟2)收集的子宮內膜干細胞接種到原代培養基上進行原代培養，培養條件為：將原代培養基放置于37±1℃，體積分數為5％CO₂的飽和濕度的培養箱中，培養的前兩天每天向培養基中添加濃度為2％-5％的海藻糖、5％-10％的腺嘌呤和5％-10％的酪氨酸，待細胞融合至85％-90％，即得原代培養細胞；其中，所述原代培養基為包括2％-5％的甘露醇、10％-14％的氯化鎂、2％-5％的SOD和1％-2％的NAC的MEM培養基。

3.如權利要求2所述的子宮內膜干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟3)所述的原代培養方法為：將步驟2)制得的子宮內膜干細胞接種于原代培養基上，將原代培養基放置于光照強度為5000-8000lx的條件下照射5-10min，再將培養基放置于培養箱中培養；其中，原代培養基在光照照射前添加濃度為10-20ng/mL的生育酚琥珀酸單酯、5-15ng/mL的聚乳酸、20-40ng/mL的肝素和12-16ng/mL的唑菌胺酯。

4.如權利要求1所述的子宮內膜干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述子宮內膜干細胞的分離培養方法還包括以下步驟：

4)細胞傳代培養：將原代培養得到的原代培養細胞接種于傳代培養基上進行傳代培養，其中，傳代培養方法為：將傳代培養基放置于37±1℃，體積分數為5％CO₂的飽和濕度的培養箱中，培養6-7天后，更換培養基，棄除未貼壁細胞，培養至第5代后，每天向傳代培養基中加入20-40重量份的增活劑，待細胞生長達到90-95％融合時用質量濃度為3％的胰蛋白酶消化收集細胞，即得傳代培養細胞。

5.如權利要求4所述的子宮內膜干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述增活劑由以下重量份的組分組成：5-10的D-半乳糖、1-2的NGF、2-5的維生素C、2-5的HEPES、5-8的罌粟堿和5-10的氯化鈉。

6.如權利要求1所述子宮內膜干細胞的分離培養方法，所述多功能振蕩器的震蕩速度為30-50r/min，所述離心機的離心速度為1000-1500r/min。

7.如權利要求4所述的子宮內膜干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述子宮內膜干細胞的分離培養方法還包括以下步驟：

5)凍存：用2-5℃的凍存液重懸步驟4)獲得的傳代培養細胞，使細胞的密度為1-2×10⁷/ml，放入凍存盒中采用程序降溫，最后轉入-196℃液氮保存。

8.如權利要求7所述的子宮內膜干細胞的分離培養方法，所述程序降溫包括如下步驟：4℃0.5-1h，-10℃1-2h，-30℃0.5-1h，-80℃12h。