[發明專利]一種冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的保護液及其制備方法和使用方法

在審

• 申請號: 201810065992.4
• 申請日: 2018-01-24
• 公開（公告）號: CN108077243A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 曹毓琳;劉俊江;時兆田;白志惠
• 申請（專利權）人: 北京臻溪谷醫學研究中心（有限合伙）
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 王玉松

本發明公開了一種冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的保護液，每100ml保護液主要由以下各成分組成：甘油1?10g、異丙醇5?15g、葡萄糖5?15g、二甲基亞砜1?10g、谷胱甘肽0.2?2g、輔酶Q10 0.5?2g、氨基酸混合物1?5g、ATP 0.1?1g，余量為去離子水。本發明的冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法和保護液，使用和制備中不包含胎牛血清，保存后細胞的活力優于或接近含血清的保護液。

技術領域

本發明屬于組織冷凍保存領域，具體涉及一種冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的保護液及其制備方法和使用方法。

背景技術

胎盤(placenta)羊膜、葉狀絨毛膜(叢密絨毛膜)和底蛻膜構成。其中羊膜和葉狀絨毛膜構成胎盤的胎兒部分，羊膜位于兩層胎膜的內層，絨毛膜位于外層。底蛻膜構成胎盤的母體部分。

人羊膜不表達人類白細胞抗原，這種免疫學特性，使得羊膜成為臨床上理想的移植材料。1940年De Rotth將帶有絨毛膜的新鮮人羊膜移植到眼球表面修復芥末缺損；1995年Kim等采用羊膜移植使化學性損傷后的眼表得以重建。羊膜在眼科的研究和引用不斷深入。

因為人胎盤羊膜和絨毛膜的提供和研究及臨床試驗的分離，人胎盤羊膜和絨毛膜的保存成為比不缺少的環節，也是關鍵環節。專利CN201210288706.3(公開號：CN102763642A，專利名稱：一種冷凍保護液以及冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的方法)公開了一種人胎盤羊膜和絨毛膜的冷凍保護液及冷凍方法，該保護液由胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40組成，胎牛血清、二甲基亞砜和右旋糖酐40的體積比為7-9:1:1。此種冷凍保護液中需要用到胎牛血清，因為瘋牛病和一些宗教的原因，一些人不愿意接受此種冷凍保護液冷凍保存的移植材料。

發明內容

針對上述問題，本發明提出了一種新的冷凍保護液及其冷凍方法，不含胎牛血清。

本發明的第一方面在于提供一種冷凍保存人胎盤羊膜和絨毛膜的保護液，每100ml保護液主要由以下各成分組成：甘油1-10g、異丙醇5-15g、葡萄糖5-15g、二甲基亞砜1-10g、谷胱甘肽0.2-2g、輔酶Q10 0.5-2g、氨基酸混合物1-5g、ATP 0.1-1g，余量為去離子水。

優選的，所述氨基酸混合物包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺。

進一步優選的，所述氨基酸混合物的精氨酸、賴氨酸、組氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺的重量比例為2:1:2:2:3。

優選的，每100ml保護液主要由以下各成分組成：甘油5g、異丙醇10g、葡萄糖10g、二甲基亞砜5g、谷胱甘肽1g、輔酶Q10 1g、氨基酸混合物3g、ATP0.5g，余量為去離子水。

本發明的第二方面在于提供一種第一方面所述的保護液的制備方法，包括以下步驟：

S11，取一半目標體積的去離子水，加入葡萄糖，溶解后，加入甘油和異丙醇，攪拌均勻，121℃濕熱滅菌，得到基質A；

S12，谷胱甘肽、輔酶Q10、氨基酸混合物和ATP用十分之一目標體積的去離子水溶解，攪拌均勻，過濾滅菌，得到基質B；

S13，無菌條件下，基質B與基質A混合，用無菌的去離子水定容至目標體積，得到保護液。

本發明的第三方面在于提供一種第一方面所述的保護液的使用方法，包括以下步驟：

S21，母體無HIV、HBV的自然生產或剖腹產的人胎盤，用有齒鑷輕輕的分離開羊膜和絨毛膜，洗盡血液，剔除血管，并剪成1.0～2.0mm3小塊，用無菌生理鹽水沖洗羊膜和絨毛膜3次；

S22，保護液預冷到-20℃；

S22，羊膜和絨毛膜轉移到冷凍管中，加入預冷的保護液至液面沒過羊膜和絨毛膜2-3cm，冷凍管的使用高度不超過1/2；