[發明專利]一種檢測FLT3-D835基因的試劑盒與應用

有效

• 申請號: 201810065764.7
• 申請日: 2018-01-23
• 公開（公告）號: CN108410981B
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 於然;劉明坤;葉鋒
• 申請（專利權）人: 北京旌準醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明涉及一種檢測FLT3?D835基因的試劑盒，包括：針對EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC設計的正向引物、針對EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC設計的反向引物、PCR反應液Mix、純水、EcoRV內切核酸酶及內切核酸酶緩沖液；相較于傳統的D835酶切方法，本發明在自行設計引物的基礎上，通過設計和調整酶切反應體系中酶活力單位與擴增產物的比例，可以提高內切酶對特異性序列的識別度；通過將酶切產物進行適當的預處理，可以降低檢出結果模棱兩可的現象。通過本發明所提供的在D835酶切過程中進行適當設計和改進，可以有效降低甚至消除D835野生型序列的陽性檢出率，并且使檢出結果更加明晰，同時為臨床標本檢測時常出現的假陽性問題和結果不明問題提供了解決方案。

技術領域

本發明涉及體外診斷試劑領域，具體涉及一種檢測FLT3-D835基因的試劑盒與應用。

背景技術

D835基因點突變是急性髓系白血病FLT3基因最重要的突變形式，突變頻率占7％。野生型D835保留了EcoRV(一種限制性內切核酸酶)的酶切識別位點，可以被EcoRV識別并切開，電泳后產生短片段；突變型D835基因由于喪失了EcoRV特異性識別位點，所以不能被EcoRV酶切掉，電泳后產生長片段。在酶切反應中，需要對過程進行質控，所以要在引物區域的任意一點設計被EcoRV識別的內標序列，在D835基因野生/突變當中，內標序列總是被EcoRV識別并被切開。

用于檢測FLT3-D835基因野生型位點的常規的檢測方法，是在酶切后產生弱陽性結果，具體表現在所擴增的D835基因片段，有一部分不包含內標序列的識別序列總不被EcoRV識別并被切開。作為一種用于體外診斷的試劑盒，在檢測臨床標本中出現的假陽性過程中會降低試劑盒使用的準確性，對臨床檢測結果產生負面影響，特別對于D835基因突變豐度極低的標本來說，不能準確的判讀實驗結果，協助臨床醫生給出明確的治療方案。

發明內容

針對現有技術中存在的缺陷，本發明的目的在于提供FLT3-D835基因酶切反應體系的設計與應用的技術方法。該技術方法是采用了改進的酶切反應方法，包括針對EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC引物的設計，包含有EcoRV內切核酸酶識別序列的FLT3-D835基因擴增產物酶切反應體系的改進，酶切產物電泳檢測前的預處理三個過程。經過設計與改進，本發明可以消除野生型D835基因酶切后產生的假陽性質控結果，為臨床標本提供更加明確的檢出結果，更好對發生低豐度D835基因突變的患者進行用藥指導，臨床應用價值潛力巨大。

為達到以上目的，本發明采取的技術方案是：

一種檢測FLT3-D835基因的試劑盒，包括：針對EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC設計的正向引物、針對EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC設計的反向引物、PCR反應液Mix、純水、EcoRV內切核酸酶及內切核酸酶緩沖液；

所述針對EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC設計正向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No1：

5’-CAGGAAACAGCTATGACCAGGAACGTGCTTGTCACCC-3’

所述針對EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC設計反向引物的核苷酸序列如SEQ.ID.No2：

5’-ACGACGGCCAGTGATATCATAGCAGCCTCACATTGCCC-3’；

經EcoRV內切核酸酶識別位點的正向引物SEQ.ID.No1和反向引物SEQ.ID.No2PCR擴增后的D835擴增產物用于設計酶切反應體系進行酶切反應，酶切產物經處理過程預處理后用于電泳檢測。

在上述方案的基礎上，擴增后的FLT3-D835產物序列均包含EcoRV內切核酸酶識別位點GATATC。