[發(fā)明專利]含酪絲纈肽并基于D構(gòu)型短肽自組裝的抗癌超分子水凝膠的制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810061416.2
• 申請(qǐng)日: 2018-01-23
• 公開（公告）號(hào): CN108379549B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉鑒峰;任春華;劉金劍;張玉民;楊翠紅;楊麗軍;黃帆;高陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): A61K38/06
• 分類號(hào): A61K38/06;A61K47/64;A61K9/06;A61P35/00
• 代理公司: 天津耀達(dá)律師事務(wù)所 12223
• 代理人: 侯力

1.一種含酪絲纈肽YSV并基于D構(gòu)型短肽自組裝的抗癌超分子水凝膠，其特征在于：利用多肽Fmoc固相合成法將抗癌短肽YSV共價(jià)修飾到成膠因子NapG^DF^DF^DY的C末端合成得到NapG^DF^DF^DYGYSV粗品；經(jīng)過(guò)反相高效液相色譜分離純化后得到純度大于95%的目的產(chǎn)物NapG^DF^DF^DYGYSV，該產(chǎn)物以大于1 mg/mL的濃度在PBS中經(jīng)加熱-冷卻形成超分子水凝膠。

2.一種權(quán)利要求1所述含酪絲纈肽YSV并基于D構(gòu)型短肽自組裝的抗癌超分子水凝膠的制備方法，其特征在于步驟如下：

第1步、將固相合成得到的NapG^DF^DF^DYGYSV粗品溶于DMSO，溶解后過(guò)0.25 μm有機(jī)濾膜，過(guò)濾后的樣品使用反相高效液相色譜進(jìn)行分離純化，收集目的產(chǎn)物峰，將收集得到的產(chǎn)物溶液進(jìn)行真空減壓旋轉(zhuǎn)濃縮，除去甲醇后加入超純水于-80 ℃冰箱冷凍，經(jīng)冷凍干燥后得到白色粉末狀多肽純品；

第2步、將多肽純品溶于PBS中，并用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH 至7.0~7.4，配置成終濃度大于1mg/mL的溶液；使用移液槍吸取100~500 μL樣品溶液于玻璃小瓶中，加熱至樣品完全溶解后，靜置于桌面上冷卻，5~10分鐘內(nèi)即可形成肉眼可見的水凝膠；

所述NapG^DF^DF^DYGYSV粗品的固相合成步驟如下：

1）稱取0.5~1 g 三苯基甲基氯樹脂于固相合成管中，加入5~8倍體積的二氯甲烷使樹脂充分溶脹后擠出溶劑；

2）稱取Fmoc-Val-OH于20 mL的小瓶中，依次加入DIEA、二氯甲烷使氨基酸充分溶解后用吸管轉(zhuǎn)移至步驟1）中的固相合成管中，室溫下振蕩反應(yīng)1小時(shí)；其中，F(xiàn)moc-Val-OH與DIEA的摩爾質(zhì)量比是1:2；

3）擠出步驟2）中的反應(yīng)液，用二氯甲烷洗滌，加入10~15 mL封端液封閉樹脂上未反應(yīng)的活性氯原子，其中封端液的配比為二氯甲烷：甲醇：DIEA=17：2：1；

4） 封閉15~30 分鐘后，擠出反應(yīng)液，用二氯甲烷洗滌，再用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）洗滌，之后加入10~15 mL 體積比為20% 的哌啶反應(yīng)30 min脫除第一個(gè)氨基酸上的Fmoc保護(hù)基使之裸露出活性氨基；

5）擠出步驟4）中的反應(yīng)液，DMF洗滌；

6）稱取Fmoc-Ser（tBu）-OH及 HBTU于20 mL的小瓶中，加入DIEA以及DMF使氨基酸充分溶解后用吸管轉(zhuǎn)移至固相合成管中，室溫下振蕩反應(yīng)2小時(shí)； 其中，F(xiàn)moc-Ser（tBu）-OH、HBTU與DIEA的摩爾質(zhì)量比為1:1:2；

7）反應(yīng)完成后，擠出步驟6）中的反應(yīng)液，DMF洗滌，加入10~15 mL 體積比為20%的哌啶反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后再用DMF洗滌；

8）重復(fù)上述6）-7）的步驟，按順序依次加入Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc- D-Phe-OH、Fmoc-D-Tyr（tBu）-OH、Fmoc- D-Phe-OH、Fmoc- D-Phe-OH、Fmoc- Gly-OH直至最后的萘乙酸，每個(gè)氨基酸的用量均是第一個(gè)氨基酸的2~3倍；

9）待肽鏈全部完成后，擠出反應(yīng)液，用DMF洗滌后再用二氯甲烷洗滌，加入5~10 mL 體積比為95%：2.5%：2.5%的三氟乙酸、水以及三異丙基硅烷的混合液反應(yīng)30~60 min將多肽從樹脂上切下來(lái)；

10）收集多肽切割液于100 mL的圓底燒瓶中，真空減壓旋轉(zhuǎn)濃縮除去三氟乙酸，加入10~20 mL無(wú)水乙醚使多肽粗品析出，靜置后輕輕棄去上面的無(wú)水乙醚，真空泵將多肽粗品抽干后于-20℃保存待純化。

3.權(quán)利要求1所述含酪絲纈肽YSV并基于D構(gòu)型短肽自組裝的抗癌超分子水凝膠在制備增強(qiáng)抗癌活性藥物方面的應(yīng)用；所述的增強(qiáng)抗癌活性指的是在體內(nèi)、體外能顯著增強(qiáng)YSV的抗癌效果。