[發(fā)明專利]一種過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810060438.7
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108251378B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張斌;尤本帥;許文榮;錢暉;董海新;張顥;金呈強
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;A61K35/28;A61P35/00
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，所述過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體的制備方法包括以下步驟：

1)將PTGDS過表達腺病毒轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細胞，經(jīng)篩選獲得PTGDS過表達間質(zhì)干細胞；

2)將所述步驟1)得到的PTGDS過表達間質(zhì)干細胞接種至含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中進行第一擴增培養(yǎng)，待細胞融合至70～80％時，采用無血清培養(yǎng)基進行第二擴增培養(yǎng)，48h后收集上清，離心去除漂浮活細胞，得到含外泌體上清；

3)采用蔗糖密度梯度離心法對所述步驟2)得到的含外泌體上清進行分離純化，得到過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，所述步驟1)中，PTGDS過表達腺病毒以10⁸的滴度進行轉(zhuǎn)染。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，步驟2)所述含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中含質(zhì)量濃度為10％的胎牛血清。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，步驟2)所述離心的條件為300×g離心10min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，步驟3)所述分離純化包括以下步驟：

a)將所述含外泌體上清在2000×g離心10min，得到去除細胞碎片的上清；

b)將所述去除細胞碎片的上清在10000×g離心30min，得到去除細胞器的上清；

c)將步驟b)得到的去除細胞器的上清進行第一濃縮，得到第一濃縮液；

d)將步驟c)得到的第一濃縮液移至1/4倍體積的蔗糖/重水密度墊，100000×g離心3h，收集底部的蔗糖/重水層，進行第二濃縮，得到第二濃縮液；

e)將所述步驟d)得到的第二濃縮液進行洗滌，過濾除菌后得到過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，所述第一濃縮和所述第二濃縮的條件獨立地為：1000×g離心30 min。

7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，所述第一濃縮和所述第二濃縮的截留分子量為100kDa。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體，其特征在于，步驟d)所述洗滌采用PBS緩沖液進行，所述洗滌的次數(shù)為3次。

9.一種過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體的制備方法，包括以下步驟：

1)將PTGDS過表達腺病毒轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細胞，經(jīng)篩選獲得PTGDS過表達間質(zhì)干細胞；

2)將所述步驟1)得到的PTGDS過表達間質(zhì)干細胞接種至含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中進行第一擴增培養(yǎng)，待細胞融合至70～80％時，采用無血清培養(yǎng)基進行第二擴增培養(yǎng)，48h后收集上清，離心去除漂浮活細胞，得到含外泌體的上清；

3)采用蔗糖密度梯度離心法對所述步驟2)得到的含外泌體的上清進行分離純化，得到過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體。

10.權(quán)利要求1～8任意一項所述過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體或權(quán)利要求9所述制備方法得到的過表達PTGDS基因的間質(zhì)干細胞外泌體在制備預(yù)防或治療胃癌藥物中的應(yīng)用。