[發明專利]一種利用多重熒光競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法

有效

• 申請號: 201810059593.7
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108103164B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 肖君華;陳科
• 申請（專利權）人: 東華大學;上海翼和應用生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所(普通合伙) 31233
• 代理人: 謝文凱

本發明利用多重熒光競爭性PCR對多個目標基因或位點進行拷貝數變異檢測，以多重PCR取代人工合成或質粒構建進行內參文庫構建。針對目標基因或位點和拷貝數確定的內參序列設計引物，區分序列以示區分，同時在特異引物的上下游5’端分別添加上下游通用序列。第一輪擴增構建文庫后，將內參文庫和檢測文庫混合，進行通用引物的第二輪擴增。利用檢測文庫和內參文庫的目標基因或位點的熒光比值確定目標基因或位點的拷貝數。減少了競爭性PCR需要準確定量和稀釋內參文庫的過程，使多重熒光競爭性PCR替代了復雜的多重連接探針擴增。

技術領域

本發明涉及核酸檢測領域，特別是涉及一種利用多重熒光競爭性PCR針對多個樣本的多個目標基因或位點進行拷貝數變異檢測的方法。

背景技術

拷貝數變異(copy number variation，CNV)是一種與基因功能和人類疾病發生密切相關的遺傳突變，因此CNV的研究具有重大的科研價值和臨床意義。目前多種技術被應用于CNV檢測，比如免疫熒光原位雜交、基于二代測序的CNV檢測技術(CNV-seq)、基于基于芯片的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)、數字PCR、多重可擴增探針雜交(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)、多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)和競爭性PCR。針對高通量的CNV檢測，CNV-seq和aCGH是最佳的選擇。但是針對大量樣本的多個基因或位點，CNV-seq和aCGH由于成本問題難以適用。MLPA技術適合大量樣本的多基因CNV檢測，但實驗優化過程、探針合成費用和非特異性雜交等問題影響了其大規模應用。基于高重復性、可操作性和低廉的價格，多重熒光競爭性PCR成為了檢測大量樣本的多基因或位點CNV的替代技術。多重熒光競爭性PCR檢測CNV的關鍵點是將檢測樣本和拷貝數已知的內參樣本共擴增，通過比較檢測樣本和內參樣本區段之間熒光的比值，結合內參樣本內區段的已知拷貝數，即可計算出檢測樣本區段的拷貝數。因此，多重熒光競爭性PCR檢測CNV的限制主要集中在內參樣本的構建和多重PCR中的非特異擴增。傳統多重競爭性通過人工合成或者質粒構建完成內參樣本的構建。構建完成的內參需要準確定量，并通過繁瑣的稀釋步驟，將內參濃度稀釋到和檢測樣本同一個數量級。同時通過優化多重競爭性PCR反應條件和引物設計方案去減少非特異擴增，近些年有一些多重熒光競爭性PCR策略被報道，但仍待進一步提高。

發明內容

所要解決的技術問題

本發明所要解決的技術問題是提供一種利用多重熒光競爭性PCR檢測CNV的方法，通過多重PCR方案取代傳統的人工合成或質粒構建的方案進行內參文庫構建，同時結合特異發夾引物克服傳統多重PCR技術中非特異性擴增的問題。

技術方案

本發明的第一個方面是提供一種利用多重熒光競爭性PCR針對多個目標基因或位點進行拷貝數變異檢測的方法，包括如下步驟：

(1)針對目標基因或位點、拷貝數確定的內參序列分別設計引物，使檢測樣本和內參樣本的擴增引物僅上游特異引物具有區分序列的差異，下游特異引物完全一致，同時特異引物的5’端具有通用序列；

(2)利用第一輪多重熒光競爭性PCR將內參樣本和檢測樣本分別擴增2-20個循環獲得內參文庫和檢測文庫，將內參文庫和檢測文庫混合并純化，純化產物作為第二輪擴增模板；

(3)利用攜帶熒光的通用引物進行第二輪PCR擴增，產物進行毛細管電泳檢測，通過電泳結果中檢測文庫和內參文庫的相應目標基因或位點的熒光比值，并結合拷貝數確定的內參序列的比值計算出檢測文庫中目標基因或位點的拷貝數。

上述方法的優選方式之一為，所說的區分序列為額外添加在檢測樣本所有特異引物的5’端一段特異的短片段堿基序列。