[發明專利]一種利用多重熒光競爭性PCR檢測拷貝數變異的方法

有效

• 申請號: 201810059593.7
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108103164B
• 公開（公告）日: 2022-01-11
• 發明（設計）人: 肖君華;陳科
• 申請（專利權）人: 東華大學;上海翼和應用生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所(普通合伙) 31233
• 代理人: 謝文凱

1.一種利用多重熒光競爭性PCR針對多個目標基因或位點進行拷貝數變異檢測的試劑盒，包括目標基因或位點的引物、和內參序列的引物、以及熒光通用引物，所述試劑盒采用的檢測方法包括如下步驟：

(1)針對目標基因或位點、拷貝數確定的內參序列分別設計引物，在設計的引物上下游5’端分別添加與目標區段3’末端部分序列完全互補配對序列，構成末端完全封閉發夾引物，使檢測樣本和內參樣本的擴增引物僅上游特異引物具有區分序列的差異，下游特異引物完全一致，同時特異引物的5’端具有通用序列，利用通用序列設計攜帶熒光的通用引物；所說的通用序列包括在特異引物的上下游5’端分別添加的上游通用序列和下游通用序列；

(2)利用第一輪多重熒光競爭性PCR將內參樣本和檢測樣本分別擴增2-20個循環獲得內參文庫和檢測文庫，將內參文庫和檢測文庫混合并純化，純化產物作為第二輪擴增模板；

(3)利用攜帶熒光的通用引物進行第二輪PCR擴增，產物進行毛細管電泳檢測，通過電泳結果中檢測文庫和內參文庫的相應目標基因或位點的熒光比值，并結合拷貝數確定的內參序列的比值計算出檢測文庫中目標基因或位點的拷貝數。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所說的區分序列為額外添加在檢測樣本所有特異引物的5’端一段特異的短片段堿基序列。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所說的區分序列長度為4-16堿基。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所說的區分序列為ACTG。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所說的上游通用序列標記熒光。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的第一輪PCR中上下游特異引物數為2-38對。