[發(fā)明專利]鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810059569.3
• 申請日: 2018-01-22
• 公開（公告）號: CN108165608A
• 公開（公告）日: 2018-06-15
• 發(fā)明（設計）人: 程波;楊偉俊;何江;劉沖;滿爾哈巴·海如拉;地力努爾·吐爾遜江;徐榮
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;G06F19/24
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279
• 代理人: 葉立濤;高清峰

本發(fā)明公開了鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法及其應用，包括使用PCR擴增葉綠體DNA的psbA?trnH核苷酸序列，以及構建psbA?trnH核苷酸序列的系統發(fā)育樹，本發(fā)明所涉及的鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法可快速、準確地鑒別出刺山柑和薄葉山柑，有效解決刺山柑藥材的品種鑒定、改良、以及種質資源的開發(fā)利用等問題；本發(fā)明方法適用性廣，操作簡單，易于掌握，準確性高，能夠成功實現對刺山柑和薄葉山柑兩者藥材及粉末的快速、準確鑒別。

技術領域

本發(fā)明涉及鑒別天然植物藥材的分子生物學檢測領域，特別涉及一種鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法及其應用。

背景技術

刺山柑(Capparis spinosa L.)為山柑科山柑屬植物，又名野西瓜、老鼠瓜、瓜兒菜、槌果藤等，其果實，根等為新疆地區(qū)維吾兒族，哈薩克族等民間習用藥材，用藥歷史長達數千年之久，主要用于治療風濕、關節(jié)炎、骨關節(jié)炎等疾病，其僅分布于西北干旱地區(qū)，以新疆為主產地，藥材全部來源于野生；薄葉山柑(Capparis tenera Dalz.)是白花菜科槌果藤屬的一種有毒植物，其具有神經毒性，雖然刺山柑與薄葉山柑在藥效成分含量上不同，藥理功效也各不相同，但是它們的形狀極為相似，用傳統方法不易區(qū)分，實用性不強，鑒別者需要有一定的專業(yè)背景知識及豐富的經驗，因而導致了刺山柑和薄葉山柑在市場上混淆的情況，在一定程度上影響了用藥的質量和安全。

用于植物系統發(fā)育研究和物種鑒別的DNA序列主要在葉綠體基因組和核基因組中進行選擇，其中葉綠體基因組具有結構簡單、穩(wěn)定，無重組，用通用引物易PCR擴增和測序等特點；psbA-trnH片段是位于葉綠體DNA基因組上psbA基因和trnH基因之間的一段非編碼序列，不參加轉錄翻譯過程，因而在功能上的限制較少，變異較為自由，比編碼基因能提供更多的系統發(fā)育信息，因此其變異程度相對較高，變異顯著且容易擴增和測序，現已被廣泛用于中藥材的分子鑒定。

系統進化分析的時候常常是基于某個基因的序列進行分析，通過堿基的變化和差異計算相互之間的進化關系，其中neighbor-joining就是一種常用的算法，簡稱NJ，用它計算出來的系統發(fā)育樹就叫NJ樹。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法及其應用，從而可快速、準確地鑒別出刺山柑和薄葉山柑，有效解決刺山柑藥材的品種鑒定、改良、以及種質資源的開發(fā)利用等問題。

為實現上述目的，本發(fā)明提供了一種鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法，包括使用PCR擴增葉綠體DNA的psbA-trnH核苷酸序列，以及構建psbA-trnH核苷酸序列的系統發(fā)育樹。

優(yōu)選地，上述技術方案中，所述方法包括以下步驟：

(1)提取樣品總DNA；

(2)以總DNA為模板，PCR擴增psbA-trnH核苷酸序列；

(3)對擴增產物進行測序、拼接，獲得psbA-trnH基因間隔區(qū)核苷酸序列；以及

(4)構建樣品的psbA-trnH核苷酸序列的系統發(fā)育樹。

優(yōu)選地，上述技術方案中，所述樣品為刺山柑和薄葉山柑。

優(yōu)選地，上述技術方案中，PCR擴增的特異性引物為：

F：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’(即SEQ ID NO.1)；

R：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’(即SEQ ID NO.2)。

優(yōu)選地，上述技術方案中，PCR擴增的體系為：