[發明專利]鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法及其應用在審
| 申請號： | 201810059569.3 | 申請日： | 2018-01-22 |
| 公開（公告）號： | CN108165608A | 公開（公告）日： | 2018-06-15 |
| 發明（設計）人： | 程波;楊偉俊;何江;劉沖;滿爾哈巴·海如拉;地力努爾·吐爾遜江;徐榮 | 申請（專利權）人： | 新疆維吾爾自治區藥物研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6806 | 分類號： | C12Q1/6806;G06F19/24 |
| 代理公司： | 北京中譽威圣知識產權代理有限公司 11279 | 代理人： | 葉立濤;高清峰 |
| 地址： | 830004 新疆維吾爾*** | 國省代碼： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 刺山柑 薄葉 鑒別 核苷酸序列 藥材 方法適用性 系統發育樹 葉綠體DNA 品種鑒定 有效解決 種質資源 構建 應用 改良 成功 開發 | ||
1.一種鑒別刺山柑和薄葉山柑的方法，其特征在于，包括使用PCR擴增葉綠體DNA的psbA-trnH核苷酸序列，以及構建psbA-trnH核苷酸序列的系統發育樹。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
(1)提取樣品總DNA；
(2)以總DNA為模板，PCR擴增psbA-trnH核苷酸序列；
(3)對擴增產物進行測序、拼接，獲得psbA-trnH基因間隔區核苷酸序列；以及
(4)構建樣品的psbA-trnH核苷酸序列的系統發育樹。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述樣品為刺山柑和薄葉山柑。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR擴增的特異性引物為：
F：5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’(即SEQ ID NO.1)；
R：5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’(即SEQ ID NO.2)。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，PCR擴增的體系為：
2.5mmol/L的10×PCR Buffer 2-3μL，2.5mmol/L的dNTPs 1.5-2.5μL，10μmol/L的PCR擴增的特異性引物各0.3-0.7μL，DNA模板2-4μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.2-0.3μL，補ddH2O至25μL。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，PCR擴增的體系為：
2.5mmol/L的10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，10μmol/L的PCR擴增的特異性引物各0.5μL，DNA模板3μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，補ddH2O至25μL。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，PCR擴增的條件為：94℃預變性3-7min；94℃0.5-1.5min，55℃0.5-1.5min，72℃1-2min，共29-32個循環；72℃延伸5-9min；最終置于12℃。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，PCR擴增的條件為：94℃預變性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，共30個循環；72℃延伸7min；最終置于12℃。
9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，使用序列對比軟件，構建待測樣品的psbA-trnH序列的系統發育樹，通過系統發育樹鑒別出刺山柑與薄葉山柑。
10.權利要求1-9任一項所述的方法在鑒別刺山柑與薄葉山柑的基原植物、果實、根皮、莖中的用途。
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