[發(fā)明專利]一種人胚胎體外培養(yǎng)液及培養(yǎng)系統(tǒng)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810059073.6
• 申請(qǐng)日: 2018-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN108251353B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林小貞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳韋拓生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/073
• 分類號(hào): C12N5/073;C12M1/00;C12M1/22
• 代理公司: 深圳市德錦知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44352
• 代理人: 丁敬偉

本發(fā)明提供了一種人胚胎體外培養(yǎng)液及其制備方法，屬于人類輔助生殖領(lǐng)域。所述培養(yǎng)液主要包括：硫酸慶大霉素0.01～0.05g/L，酚紅0.005～0.01g/L，乙二胺四乙酸二鈉0～0.01mM/L，氯化鈉90～116mM/L，氯化鉀2.5～10.0mM/L，二水氯化鈣0～1.8mM/L，磷酸二氫鉀0～7.16mM/L，二水硫酸鎂0.2～1.51M/L，碳酸氫鈉20～25mM/L，丙酮酸鈉0.1～7.27mM/L，乳酸鈉0～20mM/L，葡萄糖0～3.25mM/L，檸檬酸鈉0～1.0mM/L，丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mM/L，肌醇0～2.7mM/L，?；撬?.05～5mM/L，人血清蛋白5g/L，以及必需氨基酸和非必需氨基酸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于人類輔助生殖領(lǐng)域，具體涉及一種胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，包括一種能支持人類早期胚胎發(fā)育至囊胚的培養(yǎng)液及其培養(yǎng)裝置的培養(yǎng)系統(tǒng)。

背景技術(shù)

人類第一例體外受精(IVF)嬰兒誕生于1978年，從此輔助生殖蓬勃發(fā)展，相繼誕生卵子單精子注射(ICSI)，植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)，卵子或胚胎凍存等技術(shù)，極大地促進(jìn)了輔助生殖業(yè)的發(fā)展。

胚胎培養(yǎng)液為植入前胚胎提供了發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)，為臨床所需特定時(shí)期胚胎移植(ET)或進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)等操作提供了體外環(huán)境，是輔助生殖領(lǐng)域臨床或?qū)嶒?yàn)研究中不可或缺的試劑。目前國(guó)內(nèi)的培養(yǎng)系統(tǒng)普遍存在以下缺陷：(1)多采用序貫培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程需中途換液；(2)國(guó)內(nèi)大部分采購進(jìn)口試劑，價(jià)格高采購周期長(zhǎng)；(3)培養(yǎng)全過程胚胎皿底平放，無支撐胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的微環(huán)境；為此，必需有一套新的培養(yǎng)系統(tǒng)解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于人胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)的一貫式培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液包括以下成分：抑菌成份硫酸慶大霉素0.01～0.05g/L；pH指示劑酚紅0.005～0.01g/L；離子螯合劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)0～0.01mM/L；營(yíng)養(yǎng)成份氯化鈉90～116mM/L，氯化鉀2.5～10.0mM/L，二水氯化鈣0～1.8mM/L，磷酸二氫鉀0～7.16mM/L，二水硫酸鎂0.2～1.51M/L，碳酸氫鈉20～25mM/L，丙酮酸鈉0.1～7.27mM/L，乳酸鈉0～20mM/L，葡萄糖0～3.25mM/L，檸檬酸鈉0～1.0mM/L，丙胺酰谷氨酰胺0～1.0mM/L，肌醇0～2.7mM/L，?；撬?.05～5mM/L，人血清蛋白5g/L，必需氨基酸1.43～3.11％(m/m)，非必需氨基酸0.37～0.72％(m/m)。

其中，本發(fā)明所述必需氨基酸為選自L-精氨酸，L-胱氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-纈氨酸的一種或幾種。

其中，本發(fā)明所述的非必需氨基酸為選自L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-天門氨酸，L-谷氨酸，L-甘氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸的一種或幾種。

本發(fā)明所述的培養(yǎng)液，其配制所用的溶劑為超純水，其pH值為7.3±0.1，滲透壓為257～273mOsm/kg。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備所述人胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)液的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)以超純水為溶劑，分別按比例加入本發(fā)明所述的氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、二水氯化鈣、二水硫酸鎂、乙二胺四乙酸二鈉，必需氨基酸和非必需氨基酸、葡萄糖、肌醇、檸檬酸鈉、牛磺酸、丙酮酸鈉、乳酸鈉配成基礎(chǔ)液A；

(2)向基礎(chǔ)液A中按比例加入本發(fā)明所述的硫酸慶大霉素、酚紅，最后加入碳酸氫鈉，配成基礎(chǔ)液B；

(3)上述基礎(chǔ)液B放入5％二氧化碳，5％氧氣及90％氮?dú)獾呐囵B(yǎng)箱內(nèi)平衡過夜后在超凈臺(tái)內(nèi)用真空過濾泵經(jīng)0.2μm過濾膜過濾得到原液；

(4)調(diào)節(jié)上述原液pH值7.3±0.1，滲透壓257～273mOsm/kg，加入人血清白蛋白并混勻，在超凈臺(tái)內(nèi)分裝、封口，包裝后得到成品，并4℃保存。