[發明專利]基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法檢測病毒用鎖核酸引物及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201810054853.1
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108060216A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發明（設計）人: 馬學軍;王佶;張益;申辛欣;何小周
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/70;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法檢測病毒用鎖核酸引物及檢測試劑盒，屬于腸道病毒檢測技術領域。所述鎖核酸引物包括上游外引物和下游外引物，所述上游外引物和下游外引物中分別標記有2～6個LNA單體。所述鎖核酸引物能夠與內引物在同一個體系中擴增，且引物長度接近的情況下，實現一步巢式PCR檢測，同時，鎖核酸引物與常規引物相比，具有較高的檢測特異性，有利于提高檢測靈敏度。本發明提供了包含鎖核酸的試劑盒基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR原理檢測病毒。

技術領域

本發明屬于腸道病毒檢測技術領域，具體涉及基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法檢測病毒用鎖核酸引物及檢測試劑盒。

背景技術

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種被廣泛用于診斷病毒性疾病的分子診斷技術。巢式PCR(N-PCR)是標準PCR技術的變體，涉及兩個擴增步驟，所述N-PCR通常通過外引物進行首輪反應，反應結束后打開蓋子，從產物中取出一部分作為模板，加入含有內引物的管中進行第二輪反應。盡管N-PCR可以提高檢測的靈敏度，但有兩個主要的缺點：方案比傳統PCR更復雜，交叉污染的風險相對較高。

一步巢式PCR(OSN-PCR)克服了傳統的N-PCR交叉污染的風險，所述OSN-PCR方法使外部和內引物的單個管中作為封閉反應進行。這種策略使得OSN-PCR比N-PCR更快速，降低了交叉污染的可能性，并且需要更少量的試劑。在OSN-PCR中，兩個擴增反應都是連續進行的，反應管不需要打開或更換新的試劑。OSN-PCR具體是將內引物固定在反應管蓋子的內壁上，一般使用溴酚藍在22℃下將內引物在管蓋內壁處理90分鐘，直到溶液變干，第一輪PCR后，顛倒混勻反應管，使得管蓋上的內引物溶解，然后裝回PCR儀進行第二輪反應。也一些研究人員已經使用了特殊的反應容器來隔離內引物，例如，第一輪反應結束后，將試管離心，反應管中的巢式結構中的內引物溶液會釋放，然后裝回PCR儀進行第二輪反應。一些OSN-PCR方法利用內外引物不同的解鏈溫度(Tm)，主要通過外引物被設計為比內引物更長實現退火溫度差異最大化的目的，因此，兩輪PCR反應均為獨立反應。雖然上述方法均能實現一步巢式PCR方法，但是延伸和重新設計長外引物以增加Tm，由于病原體的模板較短，這限制了它們在檢測各種病原體方面的應用，產生應用局限性。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法檢測病毒用鎖核酸引物及檢測試劑盒，所述鎖核酸使不延長引物長度的情況下實現一步巢式PCR檢測。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法檢測病毒用鎖核酸引物，包括上游外引物和下游外引物，所述上游外引物和下游外引物中分別獨立標記有2～6個LNA單體。

優選的，所述LNA單體包括2,-O,4,-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體。

優選的，所述鎖核酸引物中，被LNA單體標記的位點為G或C對應的核糖。

優選的，當檢測病毒為腸道病毒時，所述上游外引物為+CY+TT+G+T+G+CGCCTGTTTT(SEQ ID No.3)；所述下游外引物為ATT+GT+CA+C+CATAAGCAGCC(SEQ ID No.4)；所述+C、+T或+G表示被LNA單體標記。

本發明提供了基于一步巢式qPCR法或一步巢式PCR法檢測病毒的試劑盒，包括內引物和所述的鎖核酸引物。

優選的，當檢測病毒為腸道病毒時，所述內引物包括上游內引物和下游內引物；

所述上游內引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

所述上游內引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

優選的，所述上游內引物和下游內引物的濃度獨立為1～100μmol/L。