[發明專利]一種特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統

有效

• 申請號: 201810054844.2
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108359692B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 夏海濱;單琳琳;張偉鋒;趙俊麗
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 李鄭建

本發明公開了一種特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統，由打靶載體和打靶供體兩部分組成，其中，打靶供體攜帶需要引入的外源DNA片段，該外源DNA片段包括T2A小肽、熒光素酶基因cDNA序列、eGFP表達框、Neomycin基因序列和上、下游同源臂序列；打靶載體含有核酸酶Cas9表達框和靶向hDGKθ的引導鏈sgRNA表達框。該報告系統的建立方法，包括篩選靶向hDGKθ基因3′非編碼區的sgRNA，構建攜帶Cas9、sgRNA表達元件的真核表達載體作為打靶載體，構建攜帶熒光素酶基因cDNA序列以及用于定點整合的上、下游同源臂和篩選基因的打靶供體，將這兩種載體共同轉染目標細胞，利用抗性基因篩選，即可完成靶向hDGKθ的熒光素酶報告系統在目標細胞中的建立。

本發明屬于生物技術和藥理學領域，涉及一種熒光素酶報告系統，特別涉及一種特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統，可用于內源性人二酰甘油激酶(hDGKθ)表達活性的監測，也可用于對DGKθ產生調控作用的新藥篩選。

背景技術

二酰甘油激酶(Diacylglycerol Kinases，DGKs)是重要的內源性脂類調節酶，能同時調控細胞內兩種第二信使——DAG和PA的濃度，參與細胞內多種信號通路。DGKθ是DGKs同工酶第五型中的唯一亞型，也是DGK亞型中了解最少的之一。DGKθ最初在小鼠腦組織中被發現，在結構上含有三個富集的半胱氨酸區域(CRD),使它有別于其他亞型(含有兩個CRD區域)。另外，其N末端具有脯氨酸/甘氨酸富集結構域，pleckstrin同源結構域(pleckstrinhomolog,PH)以及Ras相關結構域，C末端則是催化區域(catalytic domain)。這些功能結構域選擇性和不同的效應物相互作用，并影響DGKθ的轉錄效率。

有研究表明，DGKθ可能涉及2型糖尿病、癌癥、神經系統等多種疾病，是潛在的藥物治療靶點。建立一種報告系統，有效的對DGKθ基因的表達和調控進行監測，既可以研究其轉錄水平的調控機制，也可以靶向篩選活性藥物，無疑具有重要意義。

目前，基于細胞轉錄激活檢測的報告基因系統，是建立藥物篩選模型的常用手段。傳統報告基因系統一般通過體外克隆目標基因的啟動子來驅動報告基因的表達。在細胞水平，報告基因相應啟動子活性的變化，呈現出改變的熒光素酶活性，從而提供待測質粒和藥物有效性的評估依據。但這種外源啟動子活性的變化不能真實反映基因組的真實狀態，因此難以準確反映基因組上基因表達情況。

基因編輯技術的發展，使得我們可以建立一種基于細胞內源性基因表達改變的新型報告系統，例如利用CRISPR/Cas9技術，將報告基因靶向性插入到目標基因下游，使報告基因的表達直接受內源靶基因啟動子調控，能夠真實反映細胞內真實的轉錄水平。根據申請人所進行的資料檢索，到目前為止，尚沒有發現針對靶向內源性DGKθ報告系統的相關報道，也沒有關于DGKθ轉錄調控和新藥篩選的文獻資料可以參考。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統，該報告系統同時攜帶Cas9和gRNA表達框的打靶載體，在轉染時，使Cas9和sgRNA同時進入細胞，保證有效切割。

為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案：

一種特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統，其特征在于，該特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統由打靶載體和打靶供體兩部分組成，其中：

所述打靶供體攜帶需要引入的外源DNA片段，該外源DNA片段是熒光素酶基因cDNA序列和位于其兩側的上、下游同源臂；

所述的打靶載體含有核酸酶Cas9表達框，同時還含有靶向hDGKθ的引導鏈sgRNA表達框。

根據本發明，所述的靶向hDGKθ的引導鏈sgRNA，其識別位點位于hDGKθ基因3′端，終止密碼子的下游。

進一步地，所述的靶向是指將熒光素酶基因定點整合于hDGKθ基因組下游，使其受內源性DGKθ基因啟動子的調控。