[發(fā)明專利]一種特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810054844.2
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108359692B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 夏海濱;單琳琳;張偉鋒;趙俊麗
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N9/22
• 代理公司: 西安恒泰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 61216
• 代理人: 李鄭建

1.一種特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統(tǒng)的建立方法，其特征在于，按下列步驟進行：

(1)篩選靶向hDGKθ基因3′非編碼區(qū)的sgRNA

從NCBI查找hDGKθ基因的基因組序列，在位于終止密碼子之后的非編碼區(qū)選擇四個sgRNA結(jié)合位點并設(shè)計相應(yīng)的sgRNA引物，將sgRNA引物退火后連接到Cas9表達載體，轉(zhuǎn)染HEK293細胞，轉(zhuǎn)染72小時后，提取基因組DNA，對打靶區(qū)域進行PCR擴增，利用T7E1法篩選具有最高切割活性的sgRNA；

(2)構(gòu)建攜帶Cas9和靶向hDGKθ基因的sgRNA的打靶載體

將篩選獲得的靶向DGKθ基因的sgRNA表達元件、Cas9表達元件依次連入真核表達載體，獲得pCas9-DGKθsgRNA；

(3)構(gòu)建攜帶上下游同源臂及外源DNA片段的打靶供體

以人源化細胞基因組為模板，PCR擴增上、下游同源臂，依次連入攜帶T2A-LuciferasecDNA-CMV-eGFP-T2A-Neomyci-SV40pA元件的表達載體的兩端；

(4)將打靶載體與打靶供體共同導(dǎo)入細胞，用篩選基因篩選，將篩選穩(wěn)定后的細胞進行克隆化，對克隆化后的細胞克隆進行測序鑒定；

其中：所述的四個sgRNA結(jié)合位點分別為：

SgRNA1：CCCGCCCTCATCCCATTGGTGA，

SgRNA2：TGTTACCCCGTGTCCCGGGTGGG，

SgRNA3：TGATCTCACTTTGTGCCCCTCGG，和

SgRNA4:CTGGTGACTTCCTTGTGTTCAGG；

所述的上游同源臂的序列如下所示：

ACACCAGGTTTGAGAAGCCACGCATGGACGACGGGCTGCTGGAG GTTGTGGGCGTGACGGGCGTCGTGCACATGGTGAGCCGCCGGCCGAGTGGGCGGGCGAGCCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCAGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCCGGTCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCGTCCCTGGTCCCTGCTCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCAGCGGTGGGCGTCCCTGATCCCCGCTGAGCCCGGCTGGCCTCTCCCGCCCCAGGGCCAGGTCCAGGGTGGGCTGCGCTCCGGAATCCGGATTGCCCAGGGTTCCTACTTCCGAGTCACGCTCCTCAAGGCCACCCCGGTGCAGGTGGACGGGGAGCCCTGGGTCCAGGCCCCGGGGCACATGATCATCTCAGCTGCTGGCCCTAAGGTATGTGGGGTGAGGCTGGAGAGCCAGGGGAGGTGGGCCGGGCTGGGCCGGCCATGGGAGTGGCCAGTGGTACCCAGGTGGTGCTGGCATGGCCGGCTGCGGCCAGGGAGCACTGACTCCGGGAGGGTGCCTGCTTCAGAGGAGGGCTGTGCCAGTGGCCAGGCGGGCCACAGGTGGCACAGGGAGCAGCCAGACAGGTCCCTCCCCTTCCGTGAAATGGGGCTGAGATGGCATCAGCTGCCCGGGGCCCCAGGACCGGGGGCTGCCCGTGTACCGTTCTTTCATCGGCCATGTCACCCTGGTCCTCTGTCCCCTGCCCTGGGACAGGTGCACATGCTGAGGAAGGCCAAGCAGAAGCCGAGGAGGGCCGGGACCACCAGGGATGCCCGGGCGGATGCTGCGCCTGCCCCTGAGAGCGATCCTAGG；

所述下游同源臂的序列如下所示：

AGGCTAGGAGGTCTCAGGTGCTGCCCTGGCAGCACCAGAGTGTGGGCCGGGCCCGAGTGTCTGCCCCTCGGCCCTCAGGGTGGGGCACTTAGCACCCAGAAGGGACCAAAAGCAGGGCATGGCGGTGCAGAGGAGTTTGGGAGGTGTAAACAGCCCATGCACGTGGAGGAGGAGCTGGCTTTCAGCCCCAGACCCCACGCTAGCACTTTCCACGCTGCTTGCCCGCTGTTGATGT GCAGTTCCCAGTGCCTGTGTGAGCCGACATCTGCTCAGTCCTATCCCTCGTCAGCGTGTGGAGACCCAGCTCCTGCAGCCCTCCTGCTCCCACGCCCCCAGACAGCTTGGTGGAGGGTCCTGCATCTGGGCCAGGCTGGGGTGCACCCAGCCAAAGACAAAGCTGCCTCCACGTGCCCAAGGATTCAGATGGTGCACTGGCCCCGGGAGGAGTCTGACCAAAAATGGAGCCCGCTCTGTGGGGAAGCCCCGACTCCCCCACGAGAAACGGTCCCACGGTGCGGATCTCCCCCTTCCCTTGTGGGGCACAGCTGGCCTGGGCCTCCAATCCTGCGGAGCTTTCCTGGGTGTGGCTTTGACCTCAGAAGTGGCTCTGGTTTGGCCTCAGGAGTGTGGCCTGGCCCAGCCTGCTGCAGCCTCCTGGGGGGCCCTTGATGCCACTAATCCCCCGACCCCCCGCATCTGCCAAACTGCACAGACACACG；

利用所述建立方法構(gòu)建的特異性靶向hDGKθ基因的熒光素酶報告系統(tǒng)，熒光素酶基因可以被定點整合到hDGKθ基因下游，在自剪切小肽介導(dǎo)下，與hDGKθ基因同時受hDGKθ啟動子轉(zhuǎn)錄起始，實現(xiàn)了熒光素酶活性與內(nèi)源性靶基因hDGKθ活性直接相關(guān)；從而能夠篩選對DGKθ基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的上游轉(zhuǎn)錄因子或者小分子藥物；能促進hDGKθ在相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病及代謝性疾病治療中作為潛在靶標的研究。