[發(fā)明專利]透明質(zhì)酸高通量微量快速檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810052414.7
• 申請(qǐng)日: 2018-01-19
• 公開（公告）號(hào): CN108562574A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周曉鷹;魏濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 常州大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/78
• 分類號(hào): G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

透明質(zhì)酸(HA)是一種由糖醛酸和葡糖胺為雙糖結(jié)構(gòu)的大型多糖，其自然產(chǎn)品和合成產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于臨床治療、制藥、生物材料以及化妝品行業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)組織液中HA的濃度變化與一些病理生理狀態(tài)相關(guān)，例如：類風(fēng)濕、肝病和某些腫瘤患者組織液HA有顯著變化。本發(fā)明用96孔板進(jìn)行化學(xué)呈色反應(yīng)，紅紫色反應(yīng)產(chǎn)物在530nm處有最大吸收，可用酶標(biāo)儀檢測(cè)，反應(yīng)產(chǎn)物的呈色深淺及其OD值和HA濃度相關(guān)。本發(fā)明建立了HA濃度與OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用其計(jì)算生物樣品中HA的含量。本發(fā)明的特點(diǎn)是所需樣品微量(10?20μL)、樣本數(shù)大、耗材少耗時(shí)短易操作。本發(fā)明適用于藥品、生物材料和化妝品中HA含量測(cè)定，也可用于人、大鼠等的組織液或細(xì)胞液中HA濃度的體外快速測(cè)定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及到一種透明質(zhì)酸的高通量微量快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是一種由糖醛酸和葡糖胺為雙糖結(jié)構(gòu)組成的大型多糖物質(zhì)，其自然產(chǎn)品和合成產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療、制藥、生物材料(眼科手術(shù)輔助劑、預(yù)防腹腔粘連、治療關(guān)節(jié)疾病等)以及化妝品(保濕、防皺)行業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)組織和體液中HA的濃度變化與一些特定的病理生理狀態(tài)相關(guān)，例如：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝病、某些腫瘤患者組織液樣品中HA含量均有顯著變化。尤其是在肝硬化診斷方面，HA含量測(cè)定明顯優(yōu)于所有常規(guī)肝功能試驗(yàn)，這也是判斷肝纖維化的定量指標(biāo)。

現(xiàn)有的HA測(cè)定方法為免疫分析方法和生化方法。免疫分析方法是使用抗HA抗體的檢測(cè)方法，包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫法和免疫熒光法等，這類方法耗時(shí)耗材，且存在放射性輻射和生物污染等問(wèn)題。特異性HA酶消化法、HPLC法等生化方法需要進(jìn)行酶解處理，不適合用于大批量樣品的HA含量測(cè)定。目前企業(yè)普遍使用的方法大都為生化法，依照《中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY0308-透明質(zhì)酸鈉含量測(cè)定》，采用Bitter的咔唑顯色紫外分光光度計(jì)比色法，該方法前處理和測(cè)定時(shí)間都較長(zhǎng)，用比色皿單個(gè)測(cè)定、樣品使用量大且效率低。本專利申請(qǐng)的方法建立了一種微量、快速、安全的HA高通量檢測(cè)方法，無(wú)論是對(duì)化妝品行業(yè)和制藥行業(yè)以及生物材料行業(yè)、還是對(duì)實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)院臨床的HA快速檢測(cè)都有著重要意義。

本發(fā)明的原理：HA水解后產(chǎn)生的葡萄糖醛酸與咔唑試劑作用產(chǎn)生紅紫色，并在530nm處有最大吸收，可以用酶標(biāo)儀檢測(cè)。呈色的深淺與葡萄糖醛酸含量成正比，OD值和HA濃度相關(guān)。

本發(fā)明的應(yīng)用：通過(guò)制定HA標(biāo)準(zhǔn)濃度和相關(guān)吸光度(OD值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生物樣品HA含量。

本發(fā)明的特點(diǎn)：樣品微量(10-20μL)，樣板數(shù)量大(96孔板)，檢測(cè)耗時(shí)短，易操作。

發(fā)明內(nèi)容

1.發(fā)明內(nèi)容簡(jiǎn)述：

首先制備HA溶液，采用梯度稀釋法配制系列標(biāo)準(zhǔn)液。分別取20μL各系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)液于微孔(96孔板)中，置于冰上；緩慢加100μL 0.025M四硼酸鈉硫酸溶液于各孔中混勻；95℃水浴15min后置于冰上將反應(yīng)物迅速冷卻；各孔再加4μL 0.125％咔唑乙醇溶液，混勻，95℃水浴15min后，冷卻至室溫。用酶標(biāo)儀(96孔板設(shè)定)在530nm處直接測(cè)定96孔板微孔中的吸光度。

和傳統(tǒng)法比較，本方法所需樣品量減少了50-100倍，紫外分光光度計(jì)的傳統(tǒng)方法只可以每個(gè)樣品分別檢測(cè)，樣品數(shù)低且效率低。而酶標(biāo)儀的使用讓檢測(cè)樣品的數(shù)量得以提升且效率提高。

2.發(fā)明技術(shù)方案

2.1 HA標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備

稱取適量醫(yī)用級(jí)HA，加入雙蒸水稀釋，配制成10mg/mL；

2.2制備HA標(biāo)準(zhǔn)液系列(梯度稀釋法)