[發明專利]透明質酸高通量微量快速檢測方法

在審

• 申請號: 201810052414.7
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108562574A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 周曉鷹;魏濤
• 申請（專利權）人: 常州大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種涉及到透明質酸(hyaluronic acid,HA)定量快速檢測方法，特點在于本方法區別于傳統行業標準的紫外分光光度計方法，本專利是關于建立一個使用酶標儀于530nm處進行吸光度(OD值)檢測的高通量微量快速方法，步驟如下：

A.準備工作：

a.配制0.125％咔唑乙醇溶液和0.025M四硼酸鈉硫酸溶液；

b.HA標準品準備

稱取適量醫用級HA，加入雙蒸水稀釋，配制成10mg/mL；

B.制備HA標準液系列(梯度稀釋法)

制備HA濃度為0，0.078，0.156，0.312，0.625，1.25，2.50，5.00，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100，200，400，800，1600，3200，6400μg/mL系列標準液(注意：傳統法《中華人民共和國醫藥行業標準YY0308-透明質酸鈉含量測定》中標準液使用葡萄糖醛酸，其系列濃度為0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0μg/mL)。

C.微孔(96孔板)快速反應酶標儀檢測，即高通量法的建立并和傳統法比較

a.傳統法對照：15mL試管反應產物/紫外分光光度計檢測(傳統法)

參照傳統法《中華人民共和國醫藥行業標準YY0308-透明質酸鈉含量測定》所述方法用試管進行實驗，分別取1mL各標準液于各試管中，標記，置于冰水浴中，各管緩慢加5mL0.025M四硼酸鈉硫酸溶液，搖勻，95℃水浴15min后冰水浴迅速冷卻，各管加0.2mL0.125％咔唑乙醇溶液，搖勻后95℃水浴15min，冷卻至室溫。以濃度為0的試管作對照，用紫外分光光度計和比色皿(3mL)測定530nm處的吸光度，每測一個濃度都需要更換比色皿。

b.半傳統法對照：15mL試管反應產物/酶標儀檢測

分別取100μL上述在試管中反應的液體，置于微孔(96孔板)中，用酶標儀測定530nm處的吸光度。

c.微量高通量法(本專利)：微孔(96孔板)反應產物/酶標儀檢測(高通量法)

96孔板，分別取20μL各系列濃度的標準液于微孔中，置于冰上；緩慢加100μL 0.025M四硼酸鈉硫酸溶液于各孔中混勻；95℃水浴15min后置于冰上將反應物迅速冷卻；各孔再加4μL 0.125％咔唑乙醇溶液混勻，95℃水浴15min后，冷卻至室溫。用酶標儀在530nm處測定吸光度，并以標準HA濃度(橫坐標)對相應的吸光度(縱坐標)作標準曲線。檢測樣品則按標準曲線給出的公式計算樣品HA濃度。

D.HA微量高通量法的靈敏度和重復性測試

重復9次以上HA系列標準濃度微量反應和吸光度的酶標儀檢測，使用分析軟件GraphPad Prism 7以標準液濃度對相應的OD值作圖，并作數據處理，用平均值±標準偏差表示。計算本檢測方法的靈敏度(最低檢測限lower limit concentration,LLC)和重復性(變異系數the coefficient of variation,CV％)。CV值不大于10％，則檢測方法視為可重復。

E.應用實例

使用本申請建立的方法，檢測了類風濕大鼠模型中免疫前和免疫后大鼠滑膜液HA水平的變化，并發現該HA水平的變化與類風濕病變進程相關。另外，使用本申請建立的方法，檢測了某品牌面膜中HA的含量。

2.本申請建立了一個HA高通量微量檢測方法(微孔反應和酶標儀檢測)，與傳統方法對比，本方法標準曲線的結果(R²＝0.992)和傳統法的結果平行，但最低檢測限為30μg/mL,遠低于傳統法；本方法重復性好靈敏度，CV為2-7％；本方法特征在于所需樣品量少(10-20μL，微孔中生化反應)、使用試劑少和檢測時間短，并使用酶標儀一次性檢測樣本數量大(96孔板)遠優于傳統方法中使用的試管中生化反應(15mL)和紫外分光光度計與比色皿(3mL)單次檢測。由于HA的普遍存在于自然產品、生物產品和工業產品中，所以本發明可以適用于化妝品、生物產品、生物材料、藥品等中的HA含量測定，同時也可用于人、大鼠等研究對象的組織液以及實驗細胞液中HA濃度的體外微量快速測定。