[發(fā)明專利]一種小麥白粉菌的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810052406.2
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108103153B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛敏峰;龔雙軍;楊立軍;向禮波;曾凡松;史文琦;喻大昭
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

本發(fā)明公開了一種小麥白粉菌的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該LAMP引物組合由正向外引物F3，反向外引物B3，正向內(nèi)引物FIP，反向內(nèi)引物BIP組成。本發(fā)明的檢測方法可同時檢測所有小麥白粉菌，并可區(qū)分其他近源白粉菌，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、操作簡便、實用性好、實現(xiàn)了等溫擴(kuò)增，可用于小麥白粉菌的高靈敏度快速檢測，易于大規(guī)模推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小麥白粉菌(Blumerialgraminisf.sp.tritici)的LAMP檢測引物組合及其LAMP檢測試劑盒和LAMP方法。

背景技術(shù)

小麥白粉菌是屬于氣流傳播的病害，主要通過白粉菌的分生孢子隨氣流傳播。在90年代之前，主要依靠傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類方法區(qū)分鑒定不同種類的白粉菌，90年代以后，隨著PCR (Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)日臻成熟，基于PCR技術(shù)的快速分子診斷方法，被廣泛應(yīng)用于包括白粉菌在內(nèi)的植物病原菌研究領(lǐng)域。較常規(guī)顯微鏡形態(tài)觀察檢測方法，PCR檢測更為精準(zhǔn)、高效和靈敏。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的等溫擴(kuò)增技術(shù)，因其操作簡單快速、特異性、靈敏度高、成本低等特點，逐漸成為可以替代傳統(tǒng)PCR 的新的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。它是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用BstDNA聚合酶的鏈置換活性在同一反應(yīng)體系中恒溫高效擴(kuò)增，大量合成目的DNA的同時，產(chǎn)生副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀。由于擴(kuò)增反應(yīng)依賴于靶DNA的6個獨立的區(qū)域，因此特異性非常高，反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，則不需要PCR儀等昂貴設(shè)備，僅用水浴鍋等能夠維持穩(wěn)定恒溫的設(shè)備即可完成，檢測成本大大降低，應(yīng)用范圍顯著擴(kuò)大，可以在田間進(jìn)行實時監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一組LAMP引物組合，能夠檢測植物病原小麥白粉菌。

本發(fā)明的另一目的是提供上述小麥白粉菌的LAMP檢測試劑盒。

本發(fā)明的另一目的是提供上述小麥白粉菌的LAMP檢測方法。

發(fā)明人經(jīng)過大量實驗和不懈努力，獲得了一種用于小麥白粉菌的LAMP引物組合，由正向外引物F3、反向外引物B3、正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP組成，各引物序列如下：

FIP：5’- TAAGCAAGAGGCTGTTTGGTCGACCCAGGATGATGTTCTCGGA-3’；

BIP：5’- TCCCTCAGTAAATGGCATTGGCAGGGTTCTTGAGCCTTAGGTAC-3’；

F3： 5’-TTGTCATCAGGGGCTACATTA-3’；

B3： 5’-GCCAACTACAGCTCACAGAG-3’。

優(yōu)選地，如上所述的一種用于小麥白粉菌的LAMP引物組合在檢測小麥白粉菌中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，如上所述的小麥白粉菌的LAMP引物組合在檢測小麥白粉菌中的應(yīng)用，可制備為一種檢測小麥白粉菌的LAMP試劑盒，包含以下成分：

(1)包含上述引物組合的引物混合液，濃度分別為：正向外引物F3 1μM、反向外引物B3 1 μM、正向內(nèi)引物FIP 8μM、反向內(nèi)引物FIP 8μM；

(2)反應(yīng)液及染料，包含：7mMdNTPs、100mMTris-HCl，50mMKCl，50mM(NH₄)₂SO4，40mMMgSO₄、0.5％Triton X-100、5MBetain、40U Bst DNA聚合酶，F(xiàn)DR；