[發明專利]一種HCBP6基因敲除細胞系及其構建方法

有效

• 申請號: 201810052325.2
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108148866B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發明（設計）人: 鐘彥偉;范華昊;張敏;史策
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三0二醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了一種HCBP6基因敲除細胞系及其構建方法。本發明所提供的構建HCBP6基因敲除細胞系的方法，是采用CRISPER/Cas9技術構建HCBP6基因敲除細胞系，所述方法以HCBP6蛋白的編碼序列中符合5’?N_X?NGG?3’或5’?CCN?N_X?3’序列排列規則的片段為靶序列；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數，N_X表示X個連續的脫氧核糖核苷酸。本發明為HCV感染機制研究打下基礎。本發明構建的HCBP6基因敲除是在基因組水平上形成移碼突變，故可以隨著細胞的分裂、增殖傳遞到下一代，形成穩定的HCBP6基因敲除細胞系。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種HCBP6基因敲除細胞系及其構建方法。

背景技術

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)是引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要病原之一。目前主要的治療手段是干擾素加利巴韋林，但是效果不十分理想，特別是不能用于肝硬化失代償期的患者。因此，進一步深入研究HCV的發病機制，研制新型抗病毒藥物具有十分重要的意義。

丙型肝炎病毒核心蛋白結合蛋白6(Hepatitis C Virus Core-Binding Protein6)是一種可以與丙型肝炎病毒核心蛋白相結合的蛋白。研究發現，HCBP6蛋白能夠上調和下調一系列不同基因的表達水平，這些差異表達的基因與細胞信號的轉導、增生、分化及生長調節密切相關。鑒于HCBP6在細胞核酸代謝和HCV感染中的重要作用，敲除HCBP6蛋白在HCBP6的功能研究中是十分重要的手段。但目前敲除或降低HCBP6表達的方法僅限于RNAi，該方法僅能瞬時降低HCBP6蛋白的表達，不能形成穩定敲除，更難以建立HCBP6表達缺失的細胞系，而且降低的程度也有限，不能完全敲除HCBP6的表達。因此，有必要研發一種從基因組中完全敲除HCBP6基因的方法。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/cas，規律成簇的間隔短回文重復序列)技術又稱為CRISPR/Cas9(CRISPR associated protein9，CRISPR相關蛋白9)核酸酶技術是新出現的一種基因組編輯工具，它能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯。crRNA(CRISPRderived RNA，CRISPR衍生RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA，反式激活RNA)結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元復合體指導Cas9核酸酶蛋白在crRNA引導序列的靶定位點剪切雙鏈DNA，從而達到對基因組DNA進行剪切或修飾的目的。

CRISPR/Cas9技術的定點剪切編輯技術最常用的是針對單個位點設計sgRNA引導Cas9在靶標序列上進行定向剪切，切割后細胞內固有的非同源末端連接途徑(NHEJ)修復過程，會造成堿基的插入與刪除，進而造成目的基因移碼突變來實現基因敲除的目的。

目前，尚未見有關利用CRISPR/Cas9系統將HCBP6基因序列進行敲除的報道。

發明內容

本發明的目的是針對目前瞬時敲除HCBP6方法的不穩定性和不徹底性，提供一種從基因組中穩定敲除HCBP6基因的方法，該方法除用于HCBP6功能研究外，還可以用于建立HCBP6表達缺失細胞系。

第一，本發明要求保護一種構建HCBP6基因敲除細胞系的方法。

本發明所提供的構建HCBP6基因敲除細胞系的方法，具體是采用CRISPER/Cas9技術構建HCBP6基因敲除細胞系，其特征在于：所述方法以HCBP6蛋白的編碼序列中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列規則的片段的“Nx”為靶序列；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數，N_X表示X個連續的脫氧核糖核苷酸；