[發(fā)明專利]一種HCBP6基因敲除細胞系及其構建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810052325.2
• 申請日: 2018-01-19
• 公開（公告）號: CN108148866B
• 公開（公告）日: 2020-09-01
• 發(fā)明（設計）人: 鐘彥偉;范華昊;張敏;史策
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三0二醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/90;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

1.一種構建HCBP6基因敲除細胞系的方法，是采用CRISPER/Cas9技術構建HCBP6基因敲除細胞系，其特征在于：所述方法以HCBP6蛋白的編碼序列中SEQ ID No.6或SEQ ID No.7為靶序列。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法為如下方法A或方法B：

方法A，包括如下步驟：

（a1）合成名稱為正向單鏈DNA1和名稱為反向單鏈DNA1的兩個單鏈DNA；所述正向單鏈DNA1的序列如SEQ ID No.8所示；所述反向單鏈DNA1的序列如SEQ ID No.9所示；

（a2）將所述正向單鏈DNA1和所述反向單鏈DNA1進行退火反應，得到雙鏈DNA1；

（a3）將所述雙鏈DNA1連接到LentiCRISPRv2質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶BsmB I的切割位點處，得到的重組質(zhì)粒記為LentiCRISPRv2-HCBP6-1；

（a4）將psPAX2質(zhì)粒、pCMV-VSVG質(zhì)粒和步驟（a3）構建的重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-HCBP6-1共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞HEK 293T，得到重組細胞，培養(yǎng)所述重組細胞得到慢病毒上清；

（a5）將步驟（a4）得到的慢病毒上清感染HepG2細胞，從感染后的細胞中獲得HCBP6基因被敲除的細胞系；

方法B，包括如下步驟：

（b1）合成名稱為正向單鏈DNA2和名稱為反向單鏈DNA2的兩個單鏈DNA；所述正向單鏈DNA2的序列如SEQ ID No.10所示；所述反向單鏈DNA2的序列如SEQ ID No.11所示；

（b2）將所述正向單鏈DNA2和所述反向單鏈DNA2進行退火反應，得到雙鏈DNA2；

（b3）將所述雙鏈DNA2連接到LentiCRISPRv2質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶BsmB I的切割位點處，得到的重組質(zhì)粒記為LentiCRISPRv2-HCBP6-2；

（b4）將psPAX2質(zhì)粒、pCMV-VSVG質(zhì)粒和步驟（b3）構建的重組質(zhì)粒LentiCRISPRv2-HCBP6-2共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞HEK 293T，得到重組細胞，培養(yǎng)所述重組細胞得到慢病毒上清；

（b5）將步驟（b4）得到的慢病毒上清感染HepG2細胞，從感染后的細胞中獲得HCBP6基因被敲除的細胞系。

3.質(zhì)粒，其特征在于：所述質(zhì)粒為權利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1或者LentiCRISPRv2-HCBP6-2。

4.成套質(zhì)粒，其特征在于：所述成套質(zhì)粒由psPAX2質(zhì)粒、pCMV-VSVG質(zhì)粒和權利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-1組成；或者由psPAX2質(zhì)粒、pCMV-VSVG質(zhì)粒和權利要求2中所述的LentiCRISPRv2-HCBP6-2組成。

5.權利要求3所述質(zhì)粒或權利要求4所述的成套質(zhì)粒的用途，其特征在于：所述用途為基于CRISPR-Cas9敲除HepG2細胞中的HCBP6基因。

6.用于構建HCBP6基因敲除細胞系的試劑盒，含有權利要求3所述的質(zhì)粒或權利要求4所述的成套質(zhì)粒及說明書；所述說明書中記載有權利要求1或2所述的方法。