[發明專利]一種穩定表達VEGF120的間充質干細胞株及其體外應用

在審

• 申請號: 201810052195.2
• 申請日: 2018-01-15
• 公開（公告）號: CN108148865A
• 公開（公告）日: 2018-06-12
• 發明（設計）人: 黃鳳杰;徐天蔚;劉俊俊;王旭昉;劉蘇子;高文遠
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種能穩定高表達外源VEGF的BM?MSCs細胞株，采用慢病毒過表達系統PLVTH?pol?IRES?puro共轉染293T細胞后收獲的慢病毒感染BM?MSCs獲得。該細胞株能修復高脂微環境下胰島微血管內皮細胞MS?1的增殖損傷，促進其生存能力，為糖尿病微血管病變的治療提供了可能的思路及方法。

技術領域

本發明涉及一種穩定表達VEGF₁₂₀基因的骨髓源間充質干細胞株及其制備方法，且這種細胞株能夠有效改善糖尿病病理環境下胰島微血管內皮細胞的增殖生存能力。

背景技術

糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，主要是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損引起，并伴有眼、腎、足、心臟等處的慢性血管并發癥。據2016年4月世界衛生組織(WHO)報告顯示：全球已有超過4億人患有糖尿病，占總人口的8.5％；近40年的時間里，成年糖尿病患者增加了3倍，且絕大部分在發展中國家；預計到2030年，糖尿病將成為第7大致死病因。而我國是全球糖尿病患者最多的國家，成年人患糖尿病及前驅糖尿病的比例也分別達到11.6％及50.1％，昂貴的醫療費用及巨大的精神壓力已摧毀了無數家庭的幸福。目前尚未找到根治糖尿病的方法，患者以藥物控制為主要治療手段，分為口服藥物治療及注射胰島素治療，而前者副作用大，后者價格昂貴，因而尋找根治糖尿病的方法已迫在眉睫。

胰島是高度血管化的器官，β細胞通過分泌血管生長因子(如VEGF，血管內皮生長因子)募集內皮細胞，而內皮細胞分泌活性因子(如HGF，肝細胞生長因子)維持β細胞正常生理功能，并在β細胞周圍形成密集毛細血管網絡，傳遞氧及營養物質，并及時對血糖改變做出應答進而精確調控。糖尿病病理狀態下，內皮細胞受到損傷，血管基底膜增厚，窗孔結構減少，有效濾過面積降低；內皮細胞線粒體腫脹，嵴排列紊亂，基質密度降低，造成信息傳遞一定程度阻斷，β細胞對機體血糖變化應答緩慢。

VEGF是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，有調控血管通透性，促進血管形成，促進內皮細胞增殖及遷移等多種生物學活性。在胰島內，VEGF主要由內分泌細胞表達分泌，在維持葡萄糖穩態及糖尿病發生發展中扮演著重要的作用。研究表明，在β細胞特異性敲除VEGF-A的轉基因小鼠中，血管密度下降，胰島超微結構發生改變，葡萄糖穩態遭到破壞；在β細胞特異性過表達VEGF-A的轉基因小鼠中，短期過表達后恢復基線會促進β細胞和內皮細胞的增殖生存，而長期過表達會導致內皮細胞大量增殖而抑制β細胞的活性。

間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種來源于發育早期中胚層的多能干細胞，其多向分化潛能及在損傷部位靶向募集的能力能直接或間接地起到糖尿病治療作用。國內外研究表明，多次尾靜脈注射MSCs能緩解II型糖尿胰島功能損傷；并且在特定誘導條件下，MSCs能分化為內皮細胞、上皮細胞修復胰島的血管損傷；而過表達VEGF的MSCs能增強胰島移植的效果，治療糖尿病小鼠下肢血管損傷，促進傷口愈合。

因而，本發明旨在MSCs中穩定高表達VEGF，利用MSCs的靶向募集作用及VEGF的血管修復作用，在體外一定程度上緩解胰島微血管內皮的損傷，為體內實驗提供依據并為糖尿病研究和治療提供一種可靠的新思路。

發明內容

本發明在于構建一種穩定過表達VEGF₁₂₀基因的骨髓源間充質干細胞株(BM-MSCs)。本發明運用PLVTH-pol-IRES-puro慢病毒過表達系統共轉染293T細胞收獲慢病毒，后用慢病毒感染BM-MSCs，成功獲得穩定過表達VEGF₁₂₀基因的BM-MSCs細胞株。

優選地，慢病毒表達系統包括過表達載體質粒PLVTH質粒、包裝質粒p8.91、包膜質粒pMD2.G，且轉染時三者質量比為4∶3∶2。

優選地，將VEGF₁₂₀基因整合到PLVTH載體時選取酶切位點為Pme I和Spe I。