[發(fā)明專利]一種檢測克羅諾桿菌的免疫磁珠層析試紙條及快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810049531.8
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108362876B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉應(yīng)旺;聶文芳;陳偉;滕軍;徐建國;姚麗
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;G01N33/569;G01N33/561;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 合肥金安專利事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 34114
• 代理人: 金惠貞

本發(fā)明涉及一種檢測克羅諾桿菌基因的免疫磁珠層析試紙條。試紙條的硝酸纖維膜上設(shè)有檢測T線和對照C線，檢測T線由100μM的長度20 bp的捕獲探針、5 mg/mL鏈霉親和素和50mM的磷酸鹽緩沖液按體積比1∶1∶6混勻的捕獲探針溶液制成；對照C線由抗牛血清白蛋白抗體溶液和磷酸緩沖液混勻的濃度1～5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液制成。用于檢測奶粉中是否存在克羅諾桿菌時(shí)，將被測奶粉通過細(xì)菌DNA提取、聚合酶鏈反應(yīng)、PCR產(chǎn)物與免疫磁珠結(jié)合制得被檢測液；將被檢測液滴加于免疫磁珠層析試紙條的樣品墊上，室溫反應(yīng)10 min，即可觀察結(jié)果。若檢測T線和對照C線均顯示黃色線條，表示被檢測液為陽性；若對照C線顯示黃色，表示被檢測液為陰性。對實(shí)際樣品的檢測反應(yīng)時(shí)間縮短至8?11 h。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于克羅諾桿菌基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及快速檢測克羅諾桿菌基因的免疫磁珠層析試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)

克羅諾桿菌（又稱阪崎腸桿菌）是腸桿菌科的一種，能引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥，死亡率高達(dá)50% 以上。克羅諾桿菌已引起世界多國相關(guān)部門的重視。據(jù)報(bào)道，國外乳業(yè)巨頭曾因此被召回產(chǎn)品。在美國FDA2002年在本土某一些國際乳業(yè)巨頭生產(chǎn)的嬰兒配方奶粉中檢出克羅諾桿菌后，2003年又一家國際乳業(yè)巨頭公司主動(dòng)召回在美國生產(chǎn)的一批檢出極微量克羅諾桿菌的罐裝早產(chǎn)兒特殊配方奶粉，克羅諾桿菌從此成為世界矚目的焦點(diǎn)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）原理憑借敏感、特異、快速的特點(diǎn)榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。因其在病原體檢測方面的獨(dú)特優(yōu)勢，因而發(fā)達(dá)國家在相關(guān)方法和儀器方面的研發(fā)非常快，成為分子生物學(xué)診斷的主流，至今仍處于學(xué)術(shù)和應(yīng)用前沿。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay，簡稱為ELISA）和膠體金免疫層析法（Colloidal Gold Irnmuno-Chromatography Assay，簡稱為GICA）由于其廉價(jià)，特異，靈敏和快速等特點(diǎn)，被廣泛地使用于致病菌的快速檢測中。但ELISA試劑需要專用的實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)人員進(jìn)行檢驗(yàn)，操作復(fù)雜，時(shí)間較長；膠體金類試劑操作簡便、快速、適于現(xiàn)場檢測，但靈敏度稍低，結(jié)果用肉眼直接觀察，會產(chǎn)生誤差，亦不能記錄。

納米免疫磁珠是含有鐵元素的超順磁納米顆粒，外面包覆著聚乙烯類高分子物質(zhì)，并可帶有羧基或氨基，用于和蛋白質(zhì)分子交聯(lián)。免疫磁珠在細(xì)胞和大分子分離、純化及診斷上都已得到應(yīng)用。免疫試紙條是一種制作簡便、操作簡單并且適宜于現(xiàn)場快速檢測的技術(shù)，一般主要有兩種方法：夾心法和競爭法，前者一般適用于檢測大分子物質(zhì)，后者適于檢測小分子物質(zhì)。試紙條上噴有檢測線和質(zhì)控線。夾心法是指當(dāng)有目標(biāo)物存在時(shí)，目標(biāo)物流經(jīng)試紙條上兩條線時(shí)，會被捕獲在檢測線上，兩條線都出現(xiàn)表示為陽性，只有質(zhì)控線即為陰性。而競爭法是指有目標(biāo)物存在時(shí)，檢測線則不顯線，即為陽性，只會出現(xiàn)質(zhì)控線，兩條線都出現(xiàn)表示為陰性。

發(fā)明內(nèi)容

為了實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、簡便地檢測出嬰幼兒乳粉中的克羅諾桿菌，本發(fā)明提供一種檢測克羅諾桿菌基因的免疫磁珠層析試紙條，同時(shí)提供一種奶粉中克羅諾桿菌的快速檢測方法。

一種檢測克羅諾桿菌基因的免疫磁珠層析試紙條包括襯板，襯板上依次銜接設(shè)有的樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊，所述硝酸纖維膜上設(shè)有隱形的檢測T線和對照C線；

所述檢測T線由100 μM的長度20 bp的捕獲探針、5 mg/mL鏈霉親和素和50 mM的磷酸鹽緩沖液以體積比1∶1∶6混勻的捕獲探針溶液制成，所述捕獲探針的DNA序列為：5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'；

所述對照C線由抗牛血清白蛋白抗體溶液和磷酸緩沖液混勻的濃度1～5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液制成。

用上述的免疫磁珠層析試紙條快速檢測奶粉中克羅諾桿菌的操作步驟如下：

（1）提取奶粉中的DNA

（1.1）奶粉均質(zhì)液的制備