[發明專利]一種檢測克羅諾桿菌的免疫磁珠層析試紙條及快速檢測方法

有效

• 申請號: 201810049531.8
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108362876B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 葉應旺;聶文芳;陳偉;滕軍;徐建國;姚麗
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;G01N33/569;G01N33/561;G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 合肥金安專利事務所(普通合伙企業) 34114
• 代理人: 金惠貞

1.一種用免疫磁珠層析試紙條快速檢測奶粉中克羅諾桿菌的方法，包括襯板，襯板上依次銜接設有的樣品墊、硝酸纖維膜和吸水墊，所述硝酸纖維膜上設有隱形的檢測T線和對照C線，其特征在于：

所述檢測T線由100 μM的長度20 bp的捕獲探針、5 mg/mL鏈霉親和素和50 mM的磷酸鹽緩沖液按體積比1∶1∶6混勻的捕獲探針溶液制成，所述捕獲探針的DNA序列為：5'-Biotin-GGCGGAGCCGAATAACTGGG-3'；

所述對照C線由抗牛血清白蛋白抗體溶液和磷酸緩沖液混勻的濃度1～5 mg/mL的標準溶液制成；

用所述的免疫磁珠層析試紙條快速檢測奶粉中克羅諾桿菌的操作步驟如下：

（1）提取奶粉中的DNA

（1.1）奶粉均質液的制備

將奶粉按照1:9比例進行稀釋，得到奶粉均質液；增菌培養，獲得奶粉均質液；

（1.2）奶粉均質液的裂解

將奶粉均質液離心分離，取沉淀物，加入細菌裂解液，震蕩裂解沉淀物，得到奶粉均質液的裂解物；

（1.3）磁性納米粒子吸附

向奶粉均質液的裂解物中加入溶有磁性納米粒子的吸附緩沖液，吸附均質液的裂解物中DNA，磁性分離去上清，得到吸附DNA的磁性納米粒子；

（1.4）洗滌去雜

用70%的乙醇溶液洗滌吸附DNA的磁性納米粒子兩次，去除蛋白質雜質，得到洗滌物；

（1.5）溶解DNA

將洗滌物用洗脫液溶解，渦旋混勻，磁性分離取上清，即得奶粉的細菌DNA溶液；

（2）聚合酶鏈反應

利用已合成好的分別修飾了生物素的上游引物和FITC的下游引物，以及奶粉的細菌DNA溶液進行聚合酶鏈反應，得到聚合酶鏈產物；

所述上游引物：5'-Biotin-CGTGCCCTGCATGAGAAAA-3'

所述下游引物：5'-GGCGGAGCCGAATAACTG-3’；

（3）電泳確證聚合酶鏈產物

將聚合酶鏈產物進行瓊脂糖電泳確證PCR擴增，若電泳圖上出現條帶，根據電泳圖中的條帶對比Marker得出PCR產物長度，與所查得目的片段為673 bp擴增片段，若兩者堿基數完全一致則表示PCR過程成功，可用于免疫試紙條檢測；若兩者堿基數不一致，則需優化PCR參數直到對比結果一致；若電泳圖上沒有出現條帶，則表示奶粉中不含有所需檢測的克羅諾桿菌；

（4）PCR產物與免疫磁珠結合

將聚合酶鏈產物和免疫磁珠按體積比1∶4混合反應30 min，由于PCR產物一端含有生物素，反應30 min，使免疫磁珠上的鏈霉親和素與聚合酶鏈產物產物中的生物素充分結合；磁性分離去上清，用50 μL 0.15 M的氯化鈉溶液清洗三次，用上樣液重懸至所需體積50-200μL，得到被檢測液；在均相液相中進行功能化磁珠與擴增產物的結合，可以保證反應的效率，避免了在試紙條固相界面反應不充分的弊端；利用磁性納米粒子的性能可以實現方便分離純化，無需在側向層析試紙條特意設計結合墊，節省了檢測成本和簡化了試紙條檢測制備工藝；

所述免疫磁珠由5-20 μL 5 mg/mL的鏈霉親和素與100 μL 25-50 mg/mL的帶羧基的納米磁珠偶聯制備；

（5）免疫磁珠層析試紙條的快速檢測

將被檢測液滴加于免疫磁珠層析試紙條的樣品墊上，被檢測液在毛細管作用下從試紙條上流過，室溫反應10 min，即可觀察結果；

若被檢測液中存在克羅諾桿菌基因，則被檢測液中的磁標偶聯物會直接泳動到檢測T線和硝酸纖維膜上的鏈霉親和素發生反應，從而使磁珠顆粒發生聚集，形成黃色的線條；其他未結合的磁標偶聯物繼續通過毛細管作用向前泳動，與對照C線上的牛血清白蛋白抗體發生第二次反應，同樣形成黃色線條，這樣NC膜上就會出現兩條黃色線條，表示被檢測液為陽性，其顏色強弱取決于被檢測液中目標物含量的多少；最后通過測定檢測T線上捕獲磁珠的含量實現判斷出被奶粉中克羅諾桿菌的菌落數；

若被檢測液中不存在克羅諾桿菌基因，則被檢測液中的磁標偶聯物直接泳動到對照C線處，檢測T線處就不會發生磁珠顆粒的聚集，即不會出現黃色的線條；對照C線是為檢驗磁標免疫層析方法本身是否有效而設定的，所以無論樣品中是否存在目標物，對照C線都應該顯黃色；這樣NC膜上就會出現一條黃色線條，表示被檢測液為陰性；如果對照C線不顯現出黃色，則說明試紙條失效。