[發明專利]一種LRP4抗體細胞包被微孔板制備方法

有效

• 申請號: 201810048828.2
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN108387723B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 陳志國;笪宇威;雷霖
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;C12N5/10;C12N15/867;C12N15/12
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種LRP4抗體細胞包被微孔板及制備方法和人LRP4抗體細胞免疫熒光檢測試劑盒，屬于疫檢測技術領域，所述人LRP4抗體細胞免疫熒光檢測試劑盒包括LRP4細胞包被微孔板，樣品稀釋液，陽性對照品、二抗和封閉液。本發明提供的LRP4抗體細胞包被微孔板上直接包被有LRP4?GFP?HEK293T重組細胞和EGFP?HEK293T重組細胞；避免了短時期內重復進行質粒轉染、細胞接種、細胞培養等過程次數，進而降低每次檢測的成本，縮短檢測時間。

技術領域

本發明屬于免疫檢測技術領域，具體涉及一種LRP4抗體細胞包被微孔板及制備方法和人LRP4抗體細胞免疫熒光檢測試劑盒。

背景技術

重癥肌無力(MG)是一種由自身抗體介導引起的神經肌肉接頭傳遞障礙性疾病；其中AChR抗體約占80～90％，其次是MuSK抗體。近年來研究顯示，低密度脂蛋白受體相關蛋白4(LRP4)抗體是MG的另一種抗體，可能通過阻斷agrin與MuSK結合，抑制突觸后膜AChR簇形成，進而參與MG致病過程。臨床上明確MG患者血清抗體分型有助于疾病早期診斷及精準治療。

目前用于檢測LRP4抗體的方法有酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫沉淀法(RIPA)和細胞免疫熒光染色(CBA)法，其中CBA是一種借助細胞表達靶抗原，基于利用抗原抗體之間的特異性結合來檢測目的抗體的技術；相較于其他兩種方法，CBA的靈敏度及特異度均較高，且不具有放射性，具有很好的臨床應用前景，目前國內及國際上采用方案基本如下：1.將LRP4 基因全長重組到攜帶GFP的CMV6質粒內，獲得pCMV6-LRP4-TGFP；2.分別將pCMV6-LRP4-GFP和EGFP兩種質粒轉染到HEK293T細胞中，獲得兩種轉染細胞：pCMV6-LRP4-tGFP-HEK293T和pEGFP-HEK293T。3.分別將這兩種轉染細胞接種到12或24孔板培養24h，用4％多聚甲醛(需加0.2％TritonX-100) 或純甲醇固定10-15分鐘。4.加入一抗和二抗進行孵育，并在倒置熒光顯微鏡下觀察。上述方法存在以下問題：(1)成本高，目前獲取表達LRP4蛋白的 HEK293細胞采用的是直接質粒轉染的方法，這種方法會導致重組細胞不穩定表達LRP4蛋白(質粒在傳代過程中會逐漸丟失，使得表達LRP4蛋白的HEK293 細胞在傳代過程中純度越來越低)；獲得重組細胞純度不高；而當純度低于一定比例時，需要重復質粒轉染、細胞接種等系列步驟，從而導致成本增加。此外目前重組細胞系不能長期保存，每次檢測時，需要重復進行細胞培養和接種等過程，造成成本增加。(2)耗時長，鑒于目前獲得重組細胞系的純度低且不易保存，需要經常重復進行質粒轉染、細胞接種等系列步驟，進而檢測周期長。正是由于上述檢測方法操作相對復雜，要求的實驗條件相對較高，且周期偏長，限制了其應用。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種操作簡便、現成的人LRP4抗體細胞免疫熒光檢測試劑盒，降低檢測成本，縮短檢測時間。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：一種LRP4抗體細胞包被微孔板，所述LRP4抗體細胞包被微孔板包括若干行微孔，以行為單位，每行微孔上交替包被有LRP4-GFP-HEK293T重組細胞和EGFP-HEK293T重組細胞。

本發明還提供了所述的LRP4抗體細胞包被微孔板的制備方法，包括以下步驟：1)提供LRP4-GFP-HEK293T重組細胞和EGFP-HEK293T重組細胞；2) 分別將所述LRP4-GFP-HEK293T重組細胞和EGFP-HEK293T重組細胞以行為單位，交替放于每行微孔中用固定液固定、加入細胞凍存液后置于-80～-200℃保存。

優選的，所述固定液為質量濃度3～5％的多聚甲醛。

優選的，所述固定的時間為8～12min。