[發明專利]一種高效表達anti-hEGFR基因的真核表達載體構建方法

在審

• 申請號: 201810048426.2
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN107974461A
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 任桂萍;李德山;劉春香;王宇陽
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/13
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技術領域

本發明涉及一種高效表達anti-hEGFR基因的真核表達載體構建方法，屬于分子生物學領域。

背景技術

近年來，惡性腫瘤一直作為一種頑固性疾病危害著人類健康，全球每年約有1400萬多人患有癌癥，并且有820萬人死于癌癥。其中，中國的患癌人數為307萬人，并有約220萬人死亡。目前，癌癥的治療主要還是以放療和化療為主，但放化療給人體帶來的損傷往往是不可修復的，如放射性肝、肺纖維化等。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)作為一類酪氨酸激酶受體，能夠進行細胞信號傳遞，已有研究證實，EGFR過度表達與某些腫瘤，如非小細胞肺癌(NSCLC)、結直腸癌、乳腺癌等密切相關。在癌癥患者中，通過人為干預使EGFR降低后，可以明顯改善癌癥患者的病情。人源化的EGFR抗體可以對皮膚鱗癌細胞(A431)表面的EGFR配體結合位點進行封閉，從而削弱或阻斷EGFR下游的信號傳導，達到抑制腫瘤的生長和侵襲，促進細胞凋亡的目的。這就使anti-hEGFR在治療EGFR過表達引起的癌癥方面具有很大的應用價值，為以EGFR為藥物作用靶點的癌癥治療提供了一個新的思路。

本研究以抗EGFR人源化抗體基因為模板，通過分子克隆技術克隆出anti-hEGFR的全長重鏈和全長輕鏈，將克隆好的基因連接到peedual真核表達載體，以期獲得真核表達的重組人表皮生長因子受體抗體用于癌癥的治療。

發明內容

本發明提供了一種高效表達anti-hEGFR基因的真核表達載體構建方法，得到真核蛋白表達載體Peedual-IRES-EGFP-hEGFR質粒，結構如圖11所述。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

1.hEGFR抗體重鏈及輕鏈基因的克隆。

2.將hEGFR抗體輕鏈和重鏈PCR產物膠回收純化后與pMD18-T simple克隆載體的連接。

3.轉化重組克隆載體并分別提取輕鏈及重鏈重組克隆質粒pK-LC和pK-HC。

4.LC、HC、IRES EGFP基因片段及pKlight、pee12.4、pee6.4載體的酶切制備。

5.Pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP重組載體的構建。

6.Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建。

7.去內毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR質粒的抽提及濃度測定。

附圖說明

圖1為peedual-IRES-EGFP-hEGFR重組載體的構建方案簡圖。

圖2為hEGFR重鏈和輕鏈PCR結果圖。

圖3為LC、HC片段的PCR純化產物。

圖4為LC-T、HC-T重組質粒的酶切及PCR鑒定結果圖。

圖5為LC、HC、IRES EGFP基因片段及pKlight、pee12.4、pee6.4載體的酶切制備產物回收結果。

圖6為PK-LC、PK-HC重組質粒的酶切鑒定和PCR鑒定。

圖7為各重組質粒的雙酶切產物回收結果。

圖8為pee12.4-LC、pee6.4-HC-IRES EGFP酶切及PCR鑒定。

圖9為peedual-IRES-EGFP-hEGFR酶切及PCR鑒定。

圖10為anti-hEGFR的表達SDS-PAGE分析

圖11真核蛋白表達載體Peedual-IRES-EGFP-hEGFR質粒結構圖

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。大腸桿菌E.coil DH5α，CHO-K1細胞株、真核表達載體pKlight、pee6.4(本實驗室保存)，IRES-EGFP、pee12.4(購自美國Clontech)，anti-EGFR抗體LC、HC基因片段(本實驗室保存)。

實施例1、hEGFR抗體重鏈及輕鏈基因的克隆：

以含anti-hEGFR全長基因的質粒為模板，應用pl1、pl2，ph1、ph2兩對引物分別進行抗體輕鏈和重鏈基因的PCR擴增。

PCR擴增輕鏈反應體系(25μL體系)如下：

PCR擴增重鏈反應體系(25μL體系)如下：