[發明專利]一種高效表達anti-hEGFR基因的真核表達載體構建方法

在審

• 申請號: 201810048426.2
• 申請日: 2018-01-18
• 公開（公告）號: CN107974461A
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 任桂萍;李德山;劉春香;王宇陽
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66;C12N15/65;C12N15/13
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1.一種高效表達anti-hEGFR基因的真核表達載體構建方法，其特征在于以下步驟：

(1)hEGFR抗體重鏈及輕鏈基因的克隆：

以含anti-hEGFR全長基因的質粒為模板，設計引物pl1、pl2，ph1、ph2兩對引物分別進行全長抗體輕鏈和重鏈基因的PCR擴增；

(2)Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建：

將輕鏈和重鏈插入到pKlight載體，得到質粒pK-LC和pK-HC。將pK-LC質粒經酶切后連接到pee12.4真核表達載體中；將pK-HC質粒及IRES EGFP經酶切后連接到pee6.4載體。重組后的pee6.4和pee12.4載體均用Sal I/Not I雙酶切，回收大片段并使之相連，構建出同時具有抗體輕鏈和重鏈的雙順反子真核表達載體，命名為peedual-IRES-EGFP-hEGFR；

(3)提取去內毒素的peedual-IRES-EGFP-hEGFR質粒。

2.根據權利要求1步驟(1)所述的hEGFR抗體重鏈及輕鏈基因的克隆，其特征在于：設計引物為

3.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：連接輕鏈及pKlight載體時，先經限制性內切酶Bgl II、EcoR I分別酶切后用T4連接酶連接，得到質粒pK-LC。

4.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：連接重鏈及pKlight載體時，先經限制性內切酶BamH I、Nhe I分別酶切后用T4連接酶連接，得到質粒pK-HC。

5.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：pKlight載體中含有IgKappa Leader。IgKappa Leader編碼基因序列為SEQ ID NO:8所示，氨基酸序列為SEQ ID NO:9所示。

6.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：將pK-LC經Hind III、EcoRI酶切得到含IgKappa Leader的輕鏈片段IgK-LC后連接到pee12.4真核表達載體中，得到質粒Pee12.4-LC。

7.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：將pK-HC質粒經Hind III/EcoR I雙酶切后，得到含IgKappa Leader的重鏈片段IgK-HC。

8.根據權利要求7所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：將IgK-HC用Nhe I單酶切后得到片段IgK-HC(Hind III/Nhe I)用于后續連接。

9.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：pee12.4載體和pee6.4載體經Hind III、EcoRI酶切處理后用于連接。

10.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：用Nhe I/EcoR I雙酶切處理pee12.4-IRES EGFP制備IRES EGFP片段，用于載體構建。IRES EGFP片段編碼基因序列為SEQ ID NO:3所示。

11.根據權利要求1步驟(2)所述的Peedual-IRES-EGFP-hEGFR真核表達載體的構建，其特征在于：IgK-HC(Hind III/Nhe I)與IRES EGFP片段、pEE6.4連接得到質粒Pee6.4-HC-IRES-EGFP。