[發(fā)明專利]一種植物RNAi表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810046195.1
• 申請(qǐng)日: 2018-01-17
• 公開（公告）號(hào): CN108342409B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李成偉;廖立冰;于德水;張菊;張怡;徐克東;劉坤;譚光軒;陳璨;何勇;付貝貝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 周口師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N5/10;C12N15/66
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 陳勇

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物RNAi表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明以商業(yè)化的植物表達(dá)載體pCambia2301和pHANNIBIAL為基礎(chǔ)，構(gòu)建了含有CaMV35S啟動(dòng)子、內(nèi)含子、OCS終止子、兩個(gè)方向相反的Gateway盒子的植物RNAi表達(dá)載體，該載體可利用Gateway技術(shù)進(jìn)行植物目的基因沉默載體的構(gòu)建；本發(fā)明還建立了所述植物RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建方法，以及利用融合PCR進(jìn)行一步Gateway反應(yīng)構(gòu)建含有目的基因RNAi沉默載體的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物RNAi表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

植物突變體很難獲得，有些基因的突變對(duì)植物可能是致死的，基因沉默相對(duì)容易獲得，RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù)，是一種有效的研究功能基因的反向遺傳學(xué)工具。RNAi是由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的由特定酶參與的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，該現(xiàn)象是Andrew Fire和Craig Mello等首先在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，是一種在真核生物中非常保守且普遍存在的機(jī)制，它是通過將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的具有部分雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，然后將與之同源的mRNA高效特異的降解成21～23nt的小片段，促使細(xì)胞內(nèi)特定基因缺失，最后達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的。RNAi基因沉默實(shí)驗(yàn)中，雙鏈RNA往往以發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA的形式存在。

傳統(tǒng)構(gòu)建植物RNAi表達(dá)載體，常規(guī)采用的方法是酶切和連接，對(duì)目的基因片段進(jìn)行切割并且回收，受制于限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)，既浪費(fèi)時(shí)間過程又繁瑣，并且小片段很難回收，多個(gè)片段不容易連接，質(zhì)粒載體的分子量都比較大，用酶切和連接的方法構(gòu)建載體成功率不高。

Gateway技術(shù)是Invitrogen已經(jīng)商業(yè)化的技術(shù)，它是基于噬菌體的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)，在目的片段添加重組位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物與含重組位點(diǎn)的供體載體混合進(jìn)行BP反應(yīng)獲得入門載體(Entry clone)，入門載體可以和不同用途的目標(biāo)載體進(jìn)行LR反應(yīng)獲得相應(yīng)的表達(dá)載體，也就是說利用該技術(shù)獲得表達(dá)載體通常需要通過BP反應(yīng)和LR反應(yīng)兩個(gè)步驟，實(shí)驗(yàn)周期較長，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種植物RNAi表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種植物RNAi表達(dá)載體，所述植物RNAi表達(dá)載體含有目的基因片段表達(dá)元件，所述目的基因片段表達(dá)元件含有CaMV35S啟動(dòng)子、內(nèi)含子、OCS終止子、兩個(gè)方向相反的Gateway盒子；所述內(nèi)含子位于兩個(gè)方向相反的Gateway盒子之間，用于表達(dá)發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)中的環(huán)；所述Gateway盒子含有attR1位點(diǎn)、attR2位點(diǎn)、CmR基因、ccdB基因和一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，Gateway盒子用于表達(dá)方向相反的目的基因片段，構(gòu)成發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)中的臂。

進(jìn)一步地，所述Gateway盒子是EcoRⅤ酶切pBS-Gateway-rfA載體獲得，所述EcoRⅠ酶切位點(diǎn)距離attR1位點(diǎn)453bp，距離attR2位點(diǎn)1257bp。

進(jìn)一步地，所述目的基因片段表達(dá)元件以pHANNIBAL載體為中間載體獲得；所述植物RNAi表達(dá)載體以pCambia2301載體為骨架，將目的基因片段表達(dá)元件插入pCambia2301載體的多克隆位點(diǎn)中獲得。

進(jìn)一步地，所述植物RNAi表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了上述植物RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：