[發明專利]一種植物RNAi表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201810046195.1
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN108342409B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 李成偉;廖立冰;于德水;張菊;張怡;徐克東;劉坤;譚光軒;陳璨;何勇;付貝貝
• 申請（專利權）人: 周口師范學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N5/10;C12N15/66
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 陳勇

1.一種植物RNAi表達載體的構建方法，其特征在于，所述植物RNAi表達載體含有目的基因片段表達元件，所述目的基因片段表達元件含有CaMV35S啟動子、內含子、OCS終止子、兩個方向相反的Gateway盒子；所述內含子位于兩個方向相反的Gateway盒子之間，用于表達發卡RNA結構中的環；所述Gateway盒子含有attR1位點、attR2位點、CmR基因、ccdB基因和一個EcoRI酶切位點，Gateway盒子用于表達方向相反的目的基因片段，構成發卡RNA結構中的臂；

所述植物RNAi表達載體的構建方法，包括以下步驟：

步驟1：分別用EcoRⅠ和HindⅢ單酶切pHANNIBAL載體，純化酶切后的產物，再利用高保真Taq酶補平切點，得到E片段和H片段；

步驟2：用EcoRⅤ酶切pBS-Gateway-rfA載體，回收得到Gateway盒子，所述Gateway盒子含有attR1位點、attR2位點、CmR基因、ccdB基因和一個EcoRI酶切位點；

步驟3：將步驟1中所述E片段和H片段分別與步驟2中所述Gateway盒子連接，再經篩選獲得pHANNIBAL-GW1.1載體和pHANNIBAL-GW1.2載體；所述pHANNIBAL-GW1.1載體的Gateway盒子中的attR1位點與CaMV35S啟動子連接，attR2位點與內含子連接；所述pHANNIBAL-GW1.2載體的Gateway盒子中的attR1位點與OCS終止子連接，attR2位點與內含子連接；

步驟4：用KpnⅠ和XhoⅠ對pHANNIBAL-GW1.1載體和pHANNIBAL-GW1.2載體進行雙酶切，將從pHANNIBAL-GW1.1載體切出的含有KpnⅠ和XhoⅠ粘性末端的Gateway盒子，與用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切pHANNIBAL-GW1.2載體后的片段連接，獲得含有兩個方向相反的Gateway盒子的重組載體pHANNIBAL-GW2；

步驟5：用SacⅠ和SpeⅠ雙酶切pHANNIBAL-GW2載體，回收得到目的基因片段表達元件，然后與用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切pCAMBIA2301載體后的片段連接，得到pCAMBIA2301-GW-RNAi載體，即為植物RNAi表達載體，SpeⅠ和XbaⅠ為同尾酶，切出的粘性末端之間可以進行連接。

2.根據權利要求1所述的一種植物RNAi表達載體的構建方法，其特征在于，所述Gateway盒子是EcoRⅤ酶切pBS-Gateway-rfA載體獲得，所述EcoRⅠ酶切位點距離attR1位點453bp，距離attR2位點1257bp。

3.根據權利要求1所述的一種植物RNAi表達載體的構建方法，其特征在于，所述目的基因片段表達元件以pHANNIBAL載體為中間載體獲得；所述植物RNAi表達載體以pCAMBIA2301載體為骨架，將目的基因片段表達元件插入pCAMBIA2301載體的多克隆位點中獲得。

4.根據權利要求1所述的一種植物RNAi表達載體的構建方法，其特征在于，所述植物RNAi表達載體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。