[發明專利]蜜蜂抗白堊病相關SNP位點C2587245T的檢測方法

在審

• 申請號: 201810043350.4
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN107937572A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 蘇松坤;許叔鵬;聶紅毅;羅婷;張明蓮
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種意大利蜜蜂抗白堊病相關SNP位點C2587245T的檢測方法，其特征在于檢測步驟如下：

（1）幼蟲取樣：從意大利蜜蜂蜂群中收集作為樣本的3日齡蜜蜂幼蟲，每個個體放在一個離心管中，于-80℃冷凍備用；

（2）幼蟲樣本DNA的提取：分別將步驟（1）的冷凍幼蟲進行組織破碎，提取幼蟲DNA，并進行DNA濃度和純度測定；

（3）PCR擴增含有該SNP標記的片段，標記引物序列如下：

Primer-F1：5’-GTCAAGGTATCACAAGCGTCA-3’

Primer-R1：5’-ATAGTTCGCCCACGACCA-3’；

以步驟（2）幼蟲DNA為模版，以Primer-F1和Primer-R1為引物進行PCR；將PCR反應液進行測序；

（4）鑒別幼蟲在SNP位點的堿基類型，找到在該SNP位點CC純合的幼蟲DNA模板：將步驟（3）的測序結果用SeqMan軟件進行序列分析，通過測序結果峰形圖找出在該SNP位點CC純合的幼蟲DNA模板；

（5）將CC純合幼蟲DNA模板稀釋至150ng/μl，作為標樣備用，待分型幼蟲重復步驟（1）和步驟（2），并將DNA濃度同樣稀釋至150ng/μl；

（6）PCR檢測：模板分別為CC純合幼蟲DNA模板與待分型幼蟲DNA模板，鑒別引物是針對SNP位點C2587245T設計的，只能與該位點堿基類型為C的模板進行結合的特異性引物，序列如下：

Primer-F2：5’- GTATTTTGCTTCTCGAATCACTTAATATTGCA-3’；

Primer-R2：5’- TGTAGAAGTCGTCCACCGTTGCC-3’；

對PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以CC純合DNA模板的條帶為基準，亮度不及基準條帶的模板為CT雜合型，無條帶的模板即為TT純合型。

2.根據權利要求1所述的意大利蜜蜂抗白堊病相關SNP位點C2587245T的檢測方法，其特征在于以CC型蜜蜂幼蟲DNA模板為標樣通過PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶亮度分析未知幼蟲DNA在SNP位點C2587245T的基因型。