[發明專利]蜜蜂抗白堊病相關SNP位點C2587245T的檢測方法

在審

• 申請號: 201810043350.4
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN107937572A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 蘇松坤;許叔鵬;聶紅毅;羅婷;張明蓮
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種利用PCR快速鑒別意大利蜜蜂基因型分型的方法，具體涉及意大利蜜蜂抗白堊病相關SNP位點C2587245T的檢測方法。

背景技術

白堊病是蜜蜂球囊菌引起的發生于西方蜜蜂中的真菌性傳染病，該病在全球范圍內都有流行，是目前對蜂群危害最嚴重的真菌性病害。蜜蜂白堊病會造成幼蟲大量死亡，使蜂群群勢下降，采集能力降低，影響養蜂人的經濟收入。目前國內外許多學者都有涉及到白堊病的研究，包括病理、抗病育種等方面，以期從多種角度來降低或預防白堊病的危害。就蜜蜂抗病機制、SNP技術及SNP分型方法等方面的研究概述如下：

1、蜜蜂抗病機制

蜜蜂對白堊病的抗病分為群體防御與個體免疫防御兩部分，首先從群體的角度來說蜜蜂作為社會性昆蟲，可以通過相應的群體行為，在蜂群的水平來發揮免疫，依靠群體來抵抗病原的入侵。具有衛生行為的蜂群可以顯著降低白堊病的病情，但蜜蜂必須能夠在蜜蜂球囊菌菌絲在蟲尸表面形成孢子前將其及時清理出去，如果已經形成孢子，衛生行為會導致病原傳遞給更多個體，協助病原的傳播。所以選擇培育衛生行為較強的蜂群可以在發病早期清理掉感病幼蟲從而降低損失。從蜜蜂個體免疫防御的角度來講，當病原入侵蜜蜂幼蟲時，中腸與血淋巴的生化環境會首先提供免疫，之后體液免疫與細胞免疫也會激活，產生抗菌肽或通過免疫細胞的吞噬與包裹作用來殺死入侵真菌。所以也可以通過選育幼蟲自身抗病能力強的蜂群來應對白堊病的侵染。

2、SNP技術

單核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 是第3代DNA分子標記，即在基因組特定位置的單個堿基發生轉換、顛換、插入或缺失，一般所講到的SNP通常是指轉換（嘧啶間或嘌呤間替換）和顛換（嘧啶與嘌呤互相替換）。SNP具有結構簡單、密度高、分布廣、檢測快速、易實現自動化檢測等特點，被廣泛應用于疾病研究及動植物抗病育種等領域，具有極高的實際應用價值。在蜜蜂抗白堊病分子標記的研究上，雖然未有與衛生行為相關的SNP位點的公布，但是和蜜蜂幼蟲個體抗白堊病相關的SNP已經有公布，已公開的專利《利用SNP標記鑒別蜂群抗白堊病性狀的方法》發現了SNP位點C2587245T是蜜蜂幼蟲抗白堊病相關的基因組位點，根據從蜂群中隨機收集的幼蟲個體在該SNP標記C2587245T出現C等位基因的頻率P_C和T等位基因的頻率P_T之間是否存在差異可以鑒別蜂群抗白堊病性狀，P_C越大蜂群幼蟲抗白堊病的能力越強，當鑒定蜂群的C等位基因頻率P_C > 54%，可判斷該蜂群為抗病蜂群。

3、SNP分型方法

當SNP位點確定后，面臨對樣本進行基因分型的問題，常用的基因分型的方法有PCR產物測序法、RFLP（限制性片段長度多態性）法、Taqman探針法和HRM（高分辨率熔解曲線）法等。不同SNP標記基因分型方法的操作難度和時耗都有差異，合適、易行、省時的分型方法在遺傳育種的實際應用領域具有很重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種意大利蜜蜂抗白堊病相關SNP位點C2587245T的檢測方法，通過對該位點設計特異性引物，利用PCR及電泳快速鑒別意大利蜜蜂個體抗白堊病SNP位點C2587245T基因型。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現。

本發明的意大利蜜蜂抗白堊病相關SNP位點C2587245T的檢測方法，其特征在于檢測步驟如下：

（1）幼蟲取樣：從意大利蜜蜂蜂群中收集作為樣本的3日齡蜜蜂幼蟲，每個個體放在一個離心管中，于-80℃冷凍備用；

（2）幼蟲樣本DNA的提取：分別將步驟（1）的冷凍幼蟲進行組織破碎，提取幼蟲DNA，并進行DNA濃度和純度測定；

（3）PCR擴增含有該SNP標記的片段，標記引物序列如下：

Primer-F1：5’-GTCAAGGTATCACAAGCGTCA-3’

Primer-R1：5’-ATAGTTCGCCCACGACCA-3’；

以步驟（2）幼蟲DNA為模版，以Primer-F1和Primer-R1為引物進行PCR；