[發明專利]一種葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白及其制備方法

在審

• 申請號: 201810042320.1
• 申請日: 2018-01-17
• 公開（公告）號: CN108034003A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 王云鵬;邢少辰;韋正乙;范杰英
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C07K14/485
• 分類號: C07K14/485;C12N15/82;C07K1/34;C07K1/22
• 代理公司: 北京卓嵐智財知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11624
• 代理人: 任漱晨

本發明公開了一種葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白及其制備方法，該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明還公開了一種用于生產表皮生長因子hEGF蛋白的煙草葉綠體表達載體pWYP23404。上述蛋白的制備方法包括以下步驟：構建煙草葉綠體表達載體pWYP23404，EGF基因的煙草葉綠體轉化與同質化篩選，得到煙草葉綠體轉hEGF基因的同質化植株，葉綠體轉基因煙草植株中hEGF表達量分析；表皮生長因子hEGF蛋白的純化，得到葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白。本發明在煙草葉綠體中高效表達了hEGF的GFP融合蛋白具備了商業化生產的條件。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體地說，涉及一種葉綠體表達的表皮生長因子hEGF蛋白及其制備方法。

背景技術

生長因子是細胞合成和分泌的一類活性蛋白質，在動物體內組織中，細胞、生長因子及細胞外基質共處于一個動態環境之中，三者之間的多重相互作用構成了生長因子在體內發揮作用的微環境。通過對造血細胞發育的研究，發現生長因子可通過誘導或調節基因的表達作用于細胞的增殖與分化。隨著各種生長因子及其生物學特性被不斷揭示，關于生長因子在改善各種生理、病理狀態，促進組織再生、創傷修復及愈合過程等方面的研究數據不斷積累，在醫藥等應用領域發揮著越來越重要的作用。同時，生長因子的研究也已成為生物化學、細胞生物學、醫學及組織工程學等諸多學科的研究熱點問題。

表皮生長因子(EGF)是高等動物體內的一種多肽調節因子，由53個氨基酸殘基組成，能促進表皮、內皮細胞等多種細胞的生長，提高DNA和蛋白質的合成效率。臨床上可用以治療皮膚創傷、燒傷、角膜損傷及消化性潰瘍等。然而人體內生長因子的天然含量極低，每千克組織僅可提取得到微克水平的生長因子，而至今又未找到豐富的組織來源。因此，通過基因工程手段表達上述生長因子具有十分重要的理論研究意義和市場應用前景。

葉綠體具有半自主遺傳的特點，葉綠體轉化是將外源基因通過同源重組的方法整合到葉綠體基因組上并在葉綠體中表達的操作過程。葉綠體轉化法排除了植物受體表達差異的影響，并且葉綠體遺傳為母系遺傳，不受核基因的影響，不會發生像核轉化的“基因飄移”造成的生態風險。此外，葉綠體表達消除了基因沉默的影響，且植物中葉綠體基因組的拷貝數很高，理論上每個被轉化的葉綠體中，外源基因的拷貝數可以達到1-2萬個，因此外源基因的表達量水平可以積累到很高的水平，與傳統的微生物發酵體系相比較，生產成本低廉，因而成為理想的生物反應器。此外，葉綠體基因工程生產的大多數蛋白質可完成二硫鍵交聯、正確折疊等轉錄后修飾，具有正確的空間構象和生物活性，為商業化生產醫用蛋白奠定了基礎。Staub等(Staub J M,Garcia B,Graves J,et al.Hi gh yield productionof a human therapeutic protein in tobacco chlorop last[J].Nat Biotechnol,2000,18:333-338.)人將生長素基因導入煙草葉綠體基因組中，轉基因煙草表達出的人生長素比核轉化系統高300倍，且具有正常的生物學活性。2004年，Daniell等(Daniell H,Medic al molecular Pharming,Encyclpedia of plant and crop science.2004:705-710)將胰島素生長因子IGF21基因轉入煙草葉綠體中，得到成熟的IGF21，表達量占可溶蛋白的32％，重要的是在葉綠體內IGF21可以形成正確的二硫鍵，而在大腸桿菌內則不能形成。